增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展

宋秋灵

（山东省菏泽市立医院 耳鼻喉科，山东 菏泽 274000）

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展

宋秋灵

（山东省菏泽市立医院 耳鼻喉科，山东 菏泽 274000）

目的探讨人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子及巨细胞病毒原核（CMV）增强子联合调控胸苷激酶基因增强型表达载体的改良构建及其在杀伤鼻咽癌细胞中的效应与安全性评价。方法对链接hTERT启动子及CMV增强子、胸苷激酶基因进行酶切（模板为pGL3空载体），以构建增强型表达载体；选取hTERT启动子单调控胸苷激酶基因的表达载体作为对照组。另选用人鼻咽癌细胞（端粒酶阳性，实验组）、人乳腺癌细胞（对照组）及正常人脐静脉内皮细胞（端粒酶阴性）为标本，分别对其采用荧光显微镜观察荧光蛋白表达、聚合酶链式反应（PCR）检测胸苷激酶基因mRNA的表达、Telochaser法检测细胞端粒酶活性，同时分析鼻咽癌细胞增殖及抑制受增强型载体的影响作用。结果hTERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控，可以成功改良构建；通过荧光显微镜下观察显示人鼻咽癌细胞和人乳腺癌细胞均有荧光表达，但后者较前者在表达数量及强度方面有所加强，且对照组的人乳腺癌细胞亦有荧光表达存在，但ECV-304细胞无荧光表达。在PCR定量检测方面，结果显示增强型载体组（实验组）的胸苷激酶基因mRNA的表达量显著强于对照组的单启动载体（P ＜0.05）。在细胞端粒酶活性方面，ECV-304细胞为阴性，肿瘤细胞端粒酶活性均为阳性。四甲基偶氮唑蓝（MMT）检测结果显示，增强型载体组可明显抑制鼻咽癌细胞的体外增殖，其细胞存活率较对照组显著降低（P ＜0.05）。动物体内实验结果显示改良重建的增强型载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用（抑瘤率为56.5%），显著高于单启动子载体组（抑瘤率为43.3%）（P ＜0.05）；实验组与其他对照组抑瘤率比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）。实验组裸鼠肝肾病理检查显示，肝、肾组织结构正常，均无明显损害。结论以hTERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控，成功改良构建后能够靶向及高效地杀伤鼻咽癌细胞及体外移植瘤，且应用后在动物模型体内未见明显的毒副反应。

鼻咽癌；胸苷激酶基因；端粒酶；巨细胞病毒原核

肿瘤的靶向基因治疗是当今肿瘤治疗研究的热点与难点，也是日后肿瘤治疗研究尤其是基因治疗研究的主导方向。从当前的肿瘤基因靶向治疗原则出发，治疗时采用理想型的肿瘤靶向治疗载体应当具备杀瘤细胞作用强及靶向性高的特点。国内外的实验研究及相关文献报道指出[1-2]，以人端粒酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）作为单启动子来调控胸苷激酶基因（thymidine kinase,TK）的肿瘤特异表达系统，能够在体外特异性杀伤鼻咽癌细胞及体内抑制裸鼠移植瘤的生长，且对实验动物无明显毒副作用。这一结果显示出了hTERT/TK/pGL3载体系统的优势，但是笔者在实验中及文献报道中发现，hTERT启动子调控TK基因的靶向载体虽然具有较好的靶向性，但其杀伤肿瘤细胞的效应要比巨细胞病毒原核（cytomegalovirus,CMV）增强子调控TK基因的非靶向性载体明显偏弱，即hTERT/TK/pGL3载体系统存在对肿瘤细胞杀伤力不强的缺点。为此，笔者在实验中尝试对原有载体系统（hTERT/TK/pGL3）进行改良重建，在保证载体具有良好靶向性的前提下，引入一个CMV增强子，即hTERT/CMV双调控TK基因的增强型靶向表达载体，以从理论上弥补原有靶向载体系统的不足。因此，为进一步探讨这种改良后的增强型载体系统的肿瘤系统杀伤效应，开展本研究。本研究中为能方便地检测胸苷激酶基因的载体转染率及蛋白表达率，将绿色荧光报告基因EGFP连接入改良重建后的增强型表达载体中，即胸苷激酶基因与EGFP基因融合表达（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）。现将本研究综合报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般材料

实验标本：人鼻咽癌5-8F细胞、人血管内皮细胞ECV-304和乳腺癌BT474细胞（均由山东大学微生物技术国家重点实验室提供）。

实验质粒：pGL3.Basic.EGFP-TK-hTERTp-CMV、pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp和 pGL3.basic（均由深圳大学医学院纳米磁实验室提供）。

实验试剂：RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、更昔洛韦（GCV,ROCH）；Boyden小室（Chemicon）；四甲基偶氮唑蓝（Sigma 美国）；端粒酶活性检测试剂盒（上海贤绵生物科技有限公司）；脂质体Lipofectamine 2000（上海素尔生物科技有限公司）；胸苷激酶基因、hTERT启动子及CMV增强子聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction,PCR）引物（由上海英骏公司合成）。

实验动物：5～6周龄的健康SPF级裸鼠（BALB/cnu/nu），雌雄不限，体重16～25 g（来自复旦大学实验动物中心）。

实验仪器：离心机（上海安亭科学仪器厂）、超净工作台（苏州净化设备厂）、荧光显微镜（NIKON ECLIPSE E2000，日本尼康）、电子分析天平（湖南湘仪天平厂）、恒温箱（GRANT，德国）和培养板（Corning，美国）。

增强型靶向载体的改良构建：①分析pEGFP-N1质粒信息后发现，在EGFP基因编码序列中，pGL3载体上的luc基因(荧光素酶)可通过Hind III和Xba I置换掉；而CMV增强子序列则可以通过BamH I和Sal I酶切位点将其连接入pGL3-basic中。②分析NCB I上已经提交的胸苷激酶基因序列，发现胸苷激酶基因可以通过XhoI和Hind III酶切位点插入，同时对NCB I上的hTERT基因序列进行分析后发现，hTERT基因启动子序列（hTERTp）可通过KpnI和XhoI酶切位点插入。这样就可以使胸苷激酶基因与EGFP基因完全融合。③以pEGFP-N1质粒为模板，通过PCR扩增出CMV及EGFP基因序列，分别构建出pGL3-CMV载体及pGL3-GFP载体。以pMDl8-T-hTERTp质粒为模板，通过PCR扩增出胸苷激酶基因及hTERT基因启动子序列，分别构建出pGL3-TK载体及pGL3-hTERTp载体。④分别对新构建出的载体进行酶切，分别酶切下CMV增强子基因片段及胸苷激酶基因、hTERTp基因，分别连接入pGL3-EGFP载体中从而得到单启动子载体（pGL3-EGFP-TK-hTERTp）及增强型载体（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）。

1.2 方法

1.2.1 荧光蛋白表达分析及荧光定量PCR检测基因mRNA的表达水平 常规培养人鼻咽癌细胞、人乳腺癌细胞及正常人脐静脉内皮细胞，用Lipo2000转染质粒pGL3-EGFP-TK-hTERTp、pGL3-EGFP及 pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV，每孔DNA用量、细胞数均保持一致。转染24 h后，在荧光显微镜下直接观察EGFP的表达差异；48 h后用荧光定量PCR检测胸苷激酶基因mRNA的表达水平。检测结束后，计算各组A值，并进行统计学检验。

1.2.2 端粒酶的活性检测 取对数生长期的人鼻咽癌细胞、乳腺癌细胞及正常人脐静脉内皮ECV-304细胞接种到6孔培养板中，每种细胞1孔（1、2、3），采用TeloChaser法对3孔细胞进行端粒酶活性检测。

1.2.3 Boyden小室试验 ①将Matrigel用4℃的无血清培养基稀释（终浓度为0.8 g/L），使得每个Boyden小室含有100 μl溶液含量，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，在4℃环境下风干。②取实验组转染增强型载体加GCV预处理48 h后的人鼻咽癌细胞和对照组(未做任何处理)人鼻咽癌细胞加入上室（依据细胞数1×105/200 μl的比例），另取含10%小牛血清的RPMI1640培养基500 μl加入下室，孵育24 h。③用棉签将膜上未侵袭的细胞以及人工基底膜胶擦净，进行下室面固定，而后进行结晶紫染色，在显微镜下观察每张膜的任意5个视野，每组设3个平行样本。④观察400倍显微镜视野下的穿膜细胞数，取其平均值，进行统计学分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）实验分析 ①将处于对数生长期内的人鼻咽癌细胞接种到细胞培养板中（96孔，1×105/孔），设置6个复孔；②接种12 h后对细胞培养板中的人鼻咽癌细胞进行转染，转染实验共设立5组（分别为对照组A：细胞无处理；对照组B：空载体+GCV；对照组C：单启动子载体+GCV；对照组D：增强型载体无GCV；实验组：增强型载体+GCV）；③转染实验72 h后进行MTT实验；④计算分析相关数据：首先计算细胞存活率，而后计算相对细胞存活率，最终结果以相对细胞存活率表示。

1.2.5 体内实验 取裸鼠30只，饲养于SPF级无菌饲养室，自由摄取食物和水，取对数生长期鼻咽癌细胞，制成单细胞悬液，裸鼠左侧腋部皮下注入鼻咽癌细胞进行接种。接种后第10天，当绝大多数肿瘤直径达1.2～1.5 cm时，依据不同的处理方法将荷瘤裸鼠分成6组：不作干预（空白对照组）；腹腔注射GCV（阴性对照组A）；瘤内注射脂质体，腹腔注射GCV（阴性对照组B）；瘤内注射增强型载体+脂质体（阴性对照组C）；瘤内注射单启动子载体+脂质体，腹腔注射GCV（阳性对照组）；瘤内注射增强型载体+脂质体，腹腔注射GCV（实验组）。观察6组移植瘤的生长情况，待空白组的肿瘤体积达到约6 cm3时，停止实验，断颈处死裸鼠，完整剥离肿瘤，称重，计算抑瘤率（%）=（空白组瘤块质量-治疗组瘤块质量）/空白组瘤块质量×100%。同时，取实验组裸鼠肝脏、肾脏组织，经10%的甲醛固定，送病理检查。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布及方差齐性，两组计量资料组间比较采用独立样本t检验；多组计量资料组间比较采用方差分析，其中两组计量资料比较采用Dunnet-t法；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察胸苷激酶基因绿色荧光蛋白表达

通过荧光显微镜下观察显示人鼻咽癌细胞和人乳腺癌细胞均有荧光表达，但后者较前者在表达数量及强度方面有所加强，且对照组的人乳腺癌细胞亦有荧光表达存在，但正常对照的ECV-304细胞无荧光表达。

2.2 荧光定量PCR检测胸苷激酶基因mRNA表达

在PCR定量检测方面，结果显示增强型载体组（实验组）的胸苷激酶基因mRNA的表达量显著强于对照组的单启动载体，比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.3 端粒酶活性检测结果

在细胞端粒酶活性方面，ECV-304细胞为阴性，肿瘤细胞端粒酶活性均为阳性。

2.4 MTT检测结果

转染增强型载体后的鼻咽癌细胞的生长被抑制，相对细胞存活率为（36.8±2.1）%，与启动子对照组相比较，增强型载体组可明显抑制鼻咽癌细胞的体外增殖，其细胞存活率较对照组显著降低，实验组与对照组Hep-G2细胞存活率比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 MTT法对双调控增强型载体联合前体药物杀伤鼻咽癌细胞存活率情况

2.5 Boyden小室侵袭实验结果

增强型载体对鼻咽癌细胞的侵袭力有明显抑制作用；经增强型载体处理的鼻咽癌细胞的样本高倍镜视野下平均穿膜细胞数为（20.2±2.3）个，而未处理的鼻咽癌细胞的样本高倍镜视野下平均穿膜细胞数为（63.6±1.3）个，两组平均穿模细胞数比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.6 动物体内实验结果

改良重建的增强型载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用（抑瘤率为56.5%），显著高于单启动子载体组（抑瘤率为43.3%）（P ＜0.05）；实验组与其他对照组比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）。实验组裸鼠肝肾病理检查显示，肝、肾组织结构正常，均无明显损害。见表2。

表2 各组Hep-G2细胞接种裸鼠39 d后肿瘤平均质量及抑瘤率

3 讨论

肿瘤分子靶向治疗是当前肿瘤治疗研究方面最具前景的方向，既往在临床上广泛应用的自杀基因因其杀伤细胞作用没有选择性容易引起诸多并发症，导致其在临床上进一步应用受到明显限制[3-4]。鉴于此，采用肿瘤特异性启动子调控自杀基因的分子靶向系统便成为治疗肿瘤的一种新方法。但在不影响载体的靶向性的前提下，如何选择调控元件，以提高该载体的抑瘤效应成为当前肿瘤靶向研究的一个热点。既往的实验研究和相关文献报道[5-6]，已经解决了应用单启动子靶向载体的靶向性问题，但因其抑瘤效应较低，使其应用仍然受到一定的限制。故而寻求一种既具有良好靶向性又具有良好抑瘤效应的载体系统迫在眉睫。国内一项研究通过构建hTERT启动子控制疱疹病毒胸苷激酶基因肿瘤特异表达载体（AdhTERT/TK），结果显示，该肿瘤的特异性表达载体不仅对未分化甲状腺癌及其移植瘤具有杀伤作用，还能使GCV对该肿瘤的敏感性增强，从而提升治疗效果[7]。同时有研究还显示该肿瘤特异表达系统，在靶向杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织无影响。此外，hTERTp启动子还可组合一些肿瘤杀伤因子形成新的肿瘤特异性表达载体，以发挥对肿瘤细胞凋亡的特异性诱导作用[8-9]。所以针对这种组合构建，相关研究显示，分别构建TRAIL及Bax等肿瘤特异表达载体后，除了能增强药物对肿瘤细胞的敏感性，提高治疗效果，还能靶向性杀伤肿瘤细胞并诱导其进一步凋亡，且对正常组织无明显影响[10-13]。诸如上述研究，不仅开拓了肿瘤靶向基因治疗的新领域，还为后续的研究奠定了基础。但从诸多文献报道结果来看，单纯用hTERT启动子介导各种基因载体的抑瘤效率并不高，这也成为制约肿瘤基因靶向治疗研究的难点与瓶颈[14-15]。因此，如何提高靶向载体的杀瘤效率是当前研究的关键。

针对这一研究难点与瓶颈，国内外文献已有采用hTERT启动子介导双基因等方法来提高载体抑瘤率的报道。如徐岷等[16]采用hTERT启动子及SV40增强子对胸苷激酶基因的SB系统进行调控，能够对鼻咽癌细胞进行选择性杀灭。李少一等[17]采用的腺病毒介导的TK/CD双自杀基因表达系统能在体外较高效地杀伤乳腺癌细胞。基于上述报道及相关研究，笔者尝试对原有载体系统（hTERT/TK/pGL3）进行改良重建，在保证载体具有良好靶向性的前提下，引入一个CMV增强子，即hTERT/CMV双调控TK基因的增强型靶向表达载体，以从理论上弥补原有靶向载体系统的不足。本研究从此理论基础出发，结果显示改良构建后的增强型胸苷激酶基因表达载体在鼻咽癌细胞中高效表达，且表达效率是单启动子载体的5倍。结合Boyden小室侵袭实验及动物实验结果，增强型载体组对鼻咽癌细胞的体外增殖具有明显的抑制杀伤作用，对裸鼠移植瘤亦具有明显的体内抑制作用，这些均明显强于单启动子载体组（P ＜0.05）。在不良反应方面，通过裸鼠肝肾病理检查显示，均无明显毒副作用表现。

综上所述，以hTERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控，成功改良构建后能够靶向及高效地杀伤鼻咽癌细胞及体外移植瘤，且应用后在动物模型体内未见明显的毒副反应。改良后的增强型靶向载体抑瘤作用显著提高，且载体的靶向性并无改变，体内应用具有一定安全性。本研究中增强型胸苷激酶基因载体的成功构建及其基因分子与动物实验研究为进一步恶性肿瘤靶向治疗提供依据。

[1]刘情,邓伯雄,刘亚刚,等.鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2015,42(12):3160-3166.

[2]张广宇.大肠杆菌胸苷激酶和聚磷酸激酶的重组表达与应用研究[D].广州:华东理工大学,2013.

[3]黄暨生,张广献,谭宇蕙,等.绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测[J].广州中医药大学学报,2016,33(3):384-388.

[4]李冠雪,申聪香,文忠,等.Lenti-TK介导间充质干细胞对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2013,20(2):145-152.

[5]牛颖.核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究[D].郑州:郑州大学,2014.

[6]田海飞,曾燕.肝癌HSV-TK/GCV自杀基因治疗的研究进展 [J].重庆医学,2016,45(12):1697-1699,1700.

[7]康保国,陈宏,杨茜,等.放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响[J].医学综述,2014,20(3):529- 531,封3.

[8]李少一,王志超,高芸,等.全反式维甲酸提高HSV-TK/GCV系统旁观者效应治疗髓母细胞瘤的研究[J].中国妇幼保健,2013,28(18):2986-2988.

[9]闫超,刘昊,彭海声,等.慢病毒介导CD-TK融合基因转染神经干细胞后杀伤C6胶质瘤的研究[J].中国肿瘤,2014,23(1):63-67.

[10]王静,邓志华.人类端粒酶反转录酶-肿瘤抑素联合人类端粒酶反转录酶-胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对肝癌HepG2细胞的作用[J].肿瘤研究与临床,2014,26(10):658-662.

[11]阿不都外力·吾守尔,李玲,张邦昌,等.纳米磁流体-单纯疱疹病毒胸苷激酶重组质粒的构建及其对胃癌细胞增殖的影响[J].中华胃肠外科杂志,2012,15(7):727-731.

[12]孔祥禄,邓介超.单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因对骨关节炎滑膜细胞的作用[J].国际病毒学杂志,2015,22(z1):32-34.

[13]朱瑞东,李宁.腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗肝癌的研究进展[J].中华消化外科杂志,2014,13(8):666-670.

[14]Song J,Kim C,Ochoa ER.Sleeping beauty-mediated suicide gene therapy of hepatocellular carcinoma[J].Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(1):165-168.

[15]Gu J,Andreeff M,Roth JA,et al.hTERT promoter induces tumorspecific Bax gene expression and cell killing in syngenic mouse tumor model and prevent systemic toxicity[J].Gene Ther,2002,9(1):30-37.

[16]徐岷,夏瑜,周冲,等.痘苗生长因子和胸苷激酶双基因缺失表达双荧光溶瘤痘病毒的构建及其对胰腺癌细胞的杀伤作用 [J].江苏大学学报(医学版),2016,26(2):143-146,153.

[17]李少一,高芸,刘宏宇,等.应用导入HSVtk基因的骨髓间充质干细胞治疗胶质瘤的实验研究[J].中国医科大学学报,2013,42(11):961-964.

Construction of enhanced thymidine kinase gene expression vector and its experimental study on killing efficiency

SONG Qiuling
(Department of Otorhinolaryngology,Heze Municiple Hospital of Shandong Province,Heze,Shandong 274000,China)

【Objective】To investigate the improved construction of enhanced expression vector of hTERT promoter combined with cytomegalovirus (CMV) enhancer for regulating thymidine kinase gene,and the effect and safety evaluation of killing nasopharyngeal carcinoma cells.【Methods】Link hTERT promoter,CMV enhancer and thymidine kinase gene were digested(template for pGL3 empty vector) to construct enhanced expression vector; the expression vector of thymidine kinase gene controlled by hTERT promoter was selected as the control group.Human nasopharyngeal carcinoma cells (telomerase positive,research group),human breast cancer cells (control group) and normal human umbilical vein endothelial cells (telomerase negative) were selected as samples,fluorescence microscopy was used to observe the expression of fluorescent protein,the expression of thymidine kinase gene mRNA was detected by polymerase chain reaction (PCR),and telomerase activity was detected by Telochaser assay,at the same time,the effect of enhanced vector on the proliferation and inhibition of nasopharyngeal carcinoma cells was analyzed.【Results】hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene could be successfully constructed;human nasopharyngeal carcinoma cells and breast cancer cells had fluorescence expression under fluorescence microscopy,and the latter was strengthened in expression number and expression intensity,there was fluorescence expression in human breast cancer cells in the control group,but no fluorescence expression in ECV-304 cells.In the quantitative detection of PCR,the results showed that the expression of thymidine kinase gene mRNA in the enhanced vector group was significantly stronger than that in the control group,and the difference was statistically significant (P＜0.05).In the telomerase activity of cells,ECV-304 cells were negative,and tumor cells were positive; the results of MMT detection showed that the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro was significantly inhibited in enhanced vector group,and the cell survival rate was significantly lower than that in the control group,the difference was statistically significant (P＜0.05).At the same time,in the in vivo experiment of nasopharyngeal carcinoma cells,enhanced vector also showed a significant inhibitory effect on the transplantation tumor of nasopharyngeal carcinoma,and the tumor inhibition rate of enhanced vector group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05).The differences in the tumor inhibition rate between the research group and other control groups were statistically significant (P＜0.05).The pathological examination of liver and kidney of nude mice in the research group showed normal tissue structure of liver and kidney without significant damage.【Conclusion】The improved construction of hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene,can successfully targetedly and efficiently kill nasopharyngeal carcinoma cells and transplantation tumors in vitro,and there were no obvious side effects on animal models.

nasopharyngeal carcinoma; thymidine kinase gene; telomerase; cytomegalovirus

R739

A

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.005

2017-01-19

（胥洪娟 编辑）