Slit2在肺腺癌中的表达及临床意义

王会恩 张华 赵庆涛 谷建琦 闫继东 吕铮 张志勇

·论著·

Slit2在肺腺癌中的表达及临床意义

王会恩 张华 赵庆涛 谷建琦 闫继东 吕铮 张志勇

目的探讨肺腺癌组织和癌旁肺组织中的Slit2的表达及其临床病理意义，进一步探讨Slit2与肺腺癌发生、发展的关系，为肺腺癌的发生和防治机制提供进一步的临床依据。方法收集2011年1月至2012年1月行肺腺癌手术的标本，共收集肺腺癌组织54例，癌旁正常组织20例，采用免疫组化方法检测Slit2在肺腺癌组织和癌旁肺组织中的表达水平，分析Slit2的表达差异及与临床病理特征的关系及其内在关联。结果Slit2在癌旁肺组织中的表达高于肺腺癌组织中的表达(Plt;0.05)，Slit2与肺腺癌的分化程度、淋巴结转移和临床分期相关(Plt;0.05)。结论Slit2在肺腺癌中低表达，提示Slit2可能在肿瘤的发生发展过程中起到抑制肿瘤发展的作用；肺腺癌中Slit2的表达与肺腺癌组织的分化程度、有无淋巴结转移和临床分期相关，说明Slit2与肺腺癌的恶性生物学行为密切相关，检测Slit2在肿瘤组织中的表达可为肿瘤患者的预后和监测肿瘤的生物学行为提供依据。

肺腺癌；Slit2；临床病理特征；免疫组织化学染色法

目前，我国恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，其中以肺癌的发病率位居榜首，病死率也位居前列，并且5年生存率仅有15%左右[1]。虽然医生一直致力于提高手术技术和改善化疗方案，但是肺癌患者尤其是一些晚期不能耐受手术的患者的生存率仍不是很理想[2,3]。因此，我们需要寻找新的靶点以对肺癌的治疗进行彻底的改善。Slit是体内的一种细胞外基质蛋白，并且由神经胶质细胞分泌，在体内的主要功能是起导向和迁移神经元的轴突的作用[4]，在体外的功能主要是参与感觉轴突的再生长和侧枝发芽[5,6]。哺乳动物体内的Slit包括Slit1、Slit2和Slit3三种亚型，Slit1一般表达于神经系统，后二者则一般存在于肺、肾等多种组织中[7-9]。Slit基因是一种细胞外分泌蛋白，其主要是由4p15.2编码的，其中Slit2的分子量为170～190 kD，结构域包括N端短的信号肽、四个富含亮氨酸的重复序列、九个表皮生长因子样功能区，一个ALPS区域和一个C端富含半胱氨酸的区域。近几年来，Slit2与肿瘤的关系备受关注，Slit2是一种新型的抑癌基因，在多种肿瘤中存在因启动子超甲基化表达降低或缺失现象，同时还存在促进肿瘤血管生成的作用，有较大的研究空间，很有可能成为肿瘤辅助诊断和治疗的一个新的靶点。本研究主要探讨Slit2在肺腺癌发生发展过程中的作用及其可能的抑癌通路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年1月至2012年1月在唐山市工人医院行肺腺癌根治术患者的癌组织标本，病例纳入标准为：(1)所有收集的病例诊断结果都必须符合WHO中肺癌的诊断标准，并且所有病例均经过两位副高及以上的医师进行确诊及分型。(2)患者手术前后均未经过任何系统化的治疗，比如放化疗，所有病例均排除应用免疫抑制剂治疗和伴有风湿性免疫系统相关疾病的患者，排除合并其他系统恶性疾病。(3)患者临床病理资料完善，随访资料齐全。本试验共收集肺腺癌组织54例，其中男34例，女20例；年龄36～80岁，平均年龄(54±92)岁；有淋巴结转移的病例25例，无淋巴结转移的病例29例；有胸膜侵犯的病例20例，无胸膜侵犯的病例34例；中高分化组病例22例，低分化组的病例32例；临床分期为Ⅰ和Ⅱ期的病例20例，Ⅲ和Ⅳ期34例。选取20例癌旁肺组织作为对照，其中男12例，女8例；年龄34～78岁，平均年龄(56±8)岁。2组患者在性别比、年龄等相关因素比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2 试剂 Slit2为兔抗单克隆抗体，购自中杉金桥公司，二抗等免疫组化相关试剂均购自中杉金桥公司。

1.3 方法 选取合适大小的肺腺癌组织块和癌旁肺组织块HE染色后，由经验丰富的病理医师在普通光学显微镜下找出肺腺癌区域和相应的正常组织区域，用记号笔在HE切片上做上标记，划出范围，找到对应病理号的石蜡组织块，和HE切片标记的区域进行比对，找出标记部位的石蜡组织进行免疫组化染色。免疫组化染色所有步骤均依照各个抗体的说明书进行操作，用PBS作为阴性对照(代替一抗)。

1.4 免疫组化法判断标准 Slit2蛋白表达部位主要位于细胞质，以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达，每张切片均按照染色强度和染色的百分比进行分级，依据染色强度主要分为4级；无着色与背景颜色一致，为0分，弱染色呈浅黄色，颜色略高于背景着色时，为1分，中度染色呈黄色，颜色较明显高于背景着色时，为2分，强染色呈棕褐色，颜色明显高于背景着色，为3分。依据阳性百分比主要划分为4级：染色面积为0时记为0分，染色面积为1%～25%时记为1分，染色面积为26%～50%时记为2分，染色面积gt;50%时记为3分。然后两项分数相加在0～2分为阴性表达，≥3分为阳性表达。

1.5 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率法，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色观察癌旁肺组织和肺腺癌组织中的形态学差异 癌旁肺组织肺泡大小一致，细胞排列整齐，肺泡上皮扁平、无异型性。间质无炎细胞及纤维组织增生。实性生长型及贴壁为主型等腺癌，可见肺泡管及肺泡的异常扩张，内含单层或多层的癌细胞，肺泡间隔完整，增宽，呈腺样生长；腺泡型腺癌，细胞异型性明显，结构排列不一，有的呈团块状或条索状排列，有的可见腺腔形成，排列成腺样结构或管状。见图1～4。

图1 癌旁肺组织(HE×100)

图2 腺泡型肺腺癌组织(HE×100)

图3 肺附壁生长为主型腺癌组织(HE×100)

图4 实性生长型肺腺癌组织(HE×100)

2.2 Slit2蛋白在癌旁肺组织和肺腺癌组织中的表达比较 Slit2蛋白主要表达于细胞质，在癌旁肺组织中的细胞质可见深染的棕黄色颗粒，肺腺癌组织中也可见淡染的浅黄色颗粒。Slit2在癌旁肺组织和肺腺癌组织中的阳性表达率分别为60.00%和18.51%，与癌旁肺组织相比，Slit2蛋白在肺腺癌组织中的表达明显降低，2组差异有统计学意义(χ2=12.021，P=0.001)。见图5、6，表1。

2.3 Slit2蛋白的表达与临床病理特征之间的关系 Slit2蛋白在高+中分化的肺腺癌组织中的阳性表达率为36.36%，在低分化的肺腺癌组织中的阳性表达率为6.25%，即Slit2蛋白的表达与肺腺癌的分化程度有关，差异有统计学意义(χ2=5.966,P=0.015)；Slit2蛋白在无淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性表达率为31.03%，在有淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性表达率为4.00%，即Slit2蛋白的表达与肺腺癌淋巴结是否转移相关，差异有统计学意义(χ2=4.835,P=0.028)；Slit2蛋白在Ⅰ～Ⅱ期的肺腺癌组织中的阳性表达率为45.00%，而处在Ⅲ～Ⅳ期的肺腺癌组织中的阳性表达率为2.94%，即Slit2蛋白的表达与肺腺癌的临床分期相关，差异有统计学意义(χ2=12.107,P=0.001)；而Slit2蛋白的表达与肺腺癌患者的年龄、性别、是否侵及胸膜无关，差异无统计学意义(Pgt;0.05)。见表2。

图5 Slit2蛋白在癌旁肺组织中的表达(IHC×100)

图6 Slit2蛋白在肺腺癌组织的表达(IHC×100)

表1 Slit2蛋白在癌旁正常肺组织和肺腺癌中的表达 例

3 讨论

原发性支气管肺癌(primary baonchogenic carcinoma)简称为肺癌，是一种起源于支气管腺体或黏膜上皮，常常伴有血性播散和淋巴结转移，肺组织内的细胞生长不受控制的疾病。肺癌的早期临床表现相对较复杂，症状的有无多数主要是由肿瘤的部位，具体病理类型、有无淋巴结及远处器官的转移和患者自身的耐受情况决定的。本文主要通过Slit2在肺腺癌中的表达以及与临床病理特征之间的关系，探讨Slit2在肺腺癌等恶性肿瘤发展过程中的具体作用及机制，以期为肺腺癌的治疗和预防提供有力的理论支持。

本实验结果显示Slit2蛋白在癌旁肺组织和肺腺癌组织中的阳性表达率分别为60.00%和18.51%，Slit2蛋白的表达在肺腺癌组织中的表达低于癌旁肺组织中的表达，经过统计学分析显示，2组之间的差异有统计学意义(χ2=12.021，P=0.001)。从结果中可以看出，Slit2蛋白在肺腺癌中的表达相对于癌旁肺组织呈低表达，表明Slit2可能在肺腺癌的发生过程中起到抑制作用。我们实验所得的结果与Grieshammer 等[10-13]的研究结果一致。Dallol等[14]发现在肺腺癌等缺失等位基因的肿瘤中同样存在Slit2基因超甲基化的现象，提示该基因在肿瘤体内可能已经失活。Ruo-chia Tseng 等[15]也对Slit2蛋白在肺腺癌和正常组织的表达进行了研究，发现Slit2蛋白在正常组织中的表达远高于肺癌中的表达，在肺癌组织中几乎不表达。多项研究发现，Slit2蛋白可以在乳腺癌患者体内通过调节PI3K/AKT等途径来抑制乳腺癌细胞的生长，还可能Slit2基因在乳腺癌患者体内发生超甲基化，导致Slit2的表达下调甚至缺失，进一步提示Slit2蛋白的下调可能在乳腺癌的发展过程起到了重要的作用[16-18]。此外，Dallol等[19]还发现，研究的7个神经胶质瘤细胞中会有至少5个细胞存在超甲基化现象；在多数的结直肠癌、神经母细胞瘤、Wilms瘤、成神经管细胞瘤和肾母细胞瘤中也会因为启动子区域的甲基化、等位基因的缺失等导致Slit2蛋白的表达量减低[20]。Prasad等[21]进行了体外实验，实验人员发现外源性导入Slit2或加入去甲基化药物5-氮杂胞苷时，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力就会减弱，Sonja等[22]在胶质瘤中也发现了此现象。研究人员在胶质瘤中进行了Slit/Robo1抑制实验，首先加入外源性Slit2，然后运用细胞迁移实验来观测Slit对胶质瘤细胞的运动能力的作用及影响，结果发现加入外源性的Slit2后，胶质瘤细胞会发生排斥效应，即胶质瘤细胞会向低浓度的Slit2方向运动。所以该研究人员猜测胶质瘤旁的正常组织内该蛋白的表达可能会高于胶质瘤组织中的表达，这种差值就有可能导致多数胶质瘤的发病由灰质侵袭至白质。当研究人员在胶质瘤细胞内加入Slit2后，就会抑制胶质瘤的恶性细胞向白质浸润迁移，推测可能是因为胶质瘤细胞内加入Slit2后，胶质瘤细胞中Slit2的浓度与周围正常组织中的差值就减少，使得细胞对周围组织的排斥作用减弱，导致上述所说的Slit2会抑制肿瘤细胞的迁移和浸润的作用。同时还发现Slit2导致上述现象的原因主要是因为Robo1受体的介导。

表2 Slit2蛋白的表达与肺腺癌临床病理特征之间的关系 例

本实验结果显示Slit2蛋白在高+中分化的肺腺癌组织中的阳性表达率为36.36%，在低分化的肺腺癌组织中的阳性表达率为6.25%，即Sllit2蛋白在高+中分化肺腺癌组织中的表达高于低分化组中的表达，差异有统计学意义(χ2=5.966,P=0.015)；Slit2蛋白在无淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性表达率为31.03%，在有淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性表达率为4.00%，即Slit2蛋白的表达与肺腺癌淋巴结呈负相关，即在有淋巴结组中的表达低于无淋巴结转移组中的表达，其间差异有统计学意义(χ2=4.835,P=0.028)；Slit2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期的肺腺癌组织中的阳性表达率为45.00%，而处在Ⅲ+Ⅳ期的肺腺癌组织中的阳性表达率为2.94%，即Slit2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期中的表达高于Ⅲ+Ⅳ期中的表达，差异有统计学意义(χ2=12.107,P=0.001)；进一步说明Slit2可以在肺腺癌患者体内起到抑制肿瘤转移和侵袭的作用。对于评定肺腺癌患者的预后有重要意义。而Slit2蛋白的表达与肺腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织分型以及是否侵及胸膜无关，其间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)。我们的实验结果与孙丽梅等[18]对Slit2蛋白的表达与乳腺癌的临床病理特征关系的研究结果基本一致，即Slit2蛋白在乳腺癌中会起到抑制肿瘤的发展的作用，并且与淋巴结转移等临床病理特征呈负相关，她们同样发现Slit2蛋白能够对乳腺癌的预后进行评估。以上结果均说明Slit2蛋白的表达可能在肿瘤的发展中起到抑制作用，并且很有可能是通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的生长。但其具体机制通路还不是很明确。

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ExpressionandclinicalsignificanceofSlit2inlungadenocarcinoma

WANGHui’en*,ZHANGHua,ZHAOQingtao,etal.

HebeiGeneralHospital,Hebei,Shijiazhuang050051,China

ObjectivesTo investigate the expression and clinical significance of Slit2 in lung adenocarcinoma tissues and peritumoral normal lung tissues,and to explore the correlation between Slit2 expression and pathogenesis and development of lung adenocarcinoma in order to provide more evidences for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma.MethodsFifty-four cases of lung adenocarcinoma tissues and 20 cases of peritumoral normal lung tissues were collected from the patients who underwent lung adenocarcinoma operation in Tangshan Gongren Hospital from January 2011 to January 2012. The expression levels of Slit2 were detected by immunohistochemisty,and the correlation between Slit2 expression and clinicopathological charateristics of lung adenocarcinoma was analyzed.ResultsThe expression levels of Slit2 in peritumoral normal lung tissues were significantly higher than those in lung adenocarcinoma tisues (Plt;0.05). Moreover the expression levels of Slit2 were closely correlated to the differentiation degree, lymph node metastasis and clinical staging of lung adenocarcinoma (Plt;0.05).ConclusionThe low expression of Slit2 in lung adenocarcinoma suggests that Slit2 may play an important role in inhibiting growh of tumor during pathogenesis and development of lung adenocarcinoma. Moreover the expression levels of Slit2 are closely correlated to the differentiation degree, lymph node metastasis and clinical staging of lung adenocarcinoma,which indicates that Slit2 expression is related with malignant biological behavior of lung adenocarcinoma,thus, the detection of Slit2 expression in tumor tissues can provide basis for evaluating patient’s prognosis and monitoring biological behavior of tumor.

lung adenocarcinoma; Slit2; clinicopathological charateristics; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.004

050051 石家庄市，河北省人民医院(王会恩、张华、赵庆涛、谷建琦);河北省唐山市工人医院(闫继东、吕铮、张志勇)

张志勇，063000 河北省唐山市工人医院；E-mail:wanghe_829@163.com

R 734.2

A

1002-7386(2017)24-3697-04

2017-05-22)