TLR3激动剂poly(I∶C)对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响及相关分子机制

耿瑞丽 金贺 赵培 路永刚

·论著·

TLR3激动剂poly(I∶C)对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响及相关分子机制

耿瑞丽 金贺 赵培 路永刚

目的观察TLR3激动剂poly(I∶C)对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响及相关分子机制。方法10只SPF级雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠，随机分为模型组和poly(I∶C)组，每组5只。分别给予高脂饲料、高脂饲料+腹腔注射poly(I∶C)喂养。另设5只C57BL/6J小鼠为对照组，给予普通饲料喂养。给药14周后处死小鼠。比较3组体重、纤维帽厚度、血管内-中膜厚度、血清生化指标[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)]、炎性因子[白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、黏附分子[血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素(P-selection)]、Toll样受体3(TLR3)及其下游依赖β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p 38)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化细胞外信号调节(p-ERK)蛋白表达变化。结果模型组、poly(I∶C)组小鼠体重增加明显快于对照组(Plt;0.05)，但模型组、poly(I∶C)组间体重比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。对照组主动脉管壁无斑块形成。模型组可见明显的主动脉斑块形成和血管内-中膜厚度增加(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组纤维帽厚度、血管内-中膜厚度明显减小(Plt;0.05)。与对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显增加，HDL-C、NO、SOD明显降低(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组TC、TG、LDL-C、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显降低，HDL-C、NO、SOD明显增加(Plt;0.05)。结论TLR3激动剂poly(I∶C)通过抑制TLR3/TRIF信号通路的激活及炎症因子的释放减轻ApoE-/-小鼠AS病变。

Toll样受体3；动脉粥样硬化；ApoE基因缺陷

动脉粥样硬化(AS)是以脂质代谢紊乱、主动脉管壁过量脂质沉积为特征的慢性炎症性疾病，而斑块破裂合并血栓形成是导致多种心脑血管疾病的病理基础[1-3]。近年来，AS发病率和死亡率逐年增加，寻找防治AS的药物及探索AS发生发展的分子机制至关重要[4]。Toll样受体(TLRs)是一类模式识别受体，主要表达在巨噬细胞、血管内皮细胞、T、B淋巴细胞上，而这些细胞均与AS发生发展有关[5]。TLR3是TLRs家族的重要成员，可识别双链RNA(dsRNA)及其类似物poly(I∶C)发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡等生物学功能[5,6]。研究发现，TLR3信号途径与泡沫细胞形成、血管内皮细胞功能受损及炎性反应密切相关，从而加速AS斑块形成[7-9]。然而，TLR3激动剂poly(I∶C)能否通过激活TLR3信号途径发挥抗炎、降脂、延缓AS发生发展的作用目前尚未见报道。本实验首先建立ApoE-/-小鼠AS模型，研究poly(I∶C)对AS的作用及其分子机制，以期为临床防治AS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 6～8周龄ApoE-/-小鼠10只[购自北京大学医学部，合格证号：SCXK(京2011-0012)]，体重20～30 g，随机分为2组，每组5只。模型组：给予高脂饲料喂养。poly(I∶C)组：给予高脂饲料喂养，同时腹腔注射poly(I∶C)，5 μg/g，1次/d。另设相同周龄、健康雄性C57BL/6J小鼠5只为对照组，给予普通饲料喂养，腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。给药14周后处死小鼠。

1.2 试剂与仪器 小鼠抗VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK抗体购自美国Santa Cruz 公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Gibco-BRL公司；TC、TG、LDL-c、HDL-c、NO、MDA、SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；7170A 型全自动生化分析仪购自日本日立公司；Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司。

1.3 检测方法

1.3.1 生化指标:处死小鼠前，采集小鼠尾静脉血，3 000 r/min，离心15 min，分离血清。采用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、MDA、SOD水平。

1.3.2 苏木素-伊红(HE)染色:采用HE染色检测小鼠主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度。剪去心脏，分离主动脉根部，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制作5 μm厚切片，HE染色，100倍光学显微镜下观察组织形态，Image-ProPlus 6.0软件测定主动脉纤维帽厚度和血管内-中膜厚度。

1.3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA):采用ELISA测定血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.4 Western-blot:采用Western-blot检测主动脉VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达。提取组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE电转至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，β-actin作为内参照，以目的蛋白与β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 3组体重比较 与对照组比较，模型组、poly(I∶C)组小鼠体重明显增加，差异有统计学意义(Plt;0.05)；模型组、poly(I∶C)组小鼠体重比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。见表1。

表1 3组体重比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05

2.2 3组主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度比较 对照组主动脉管壁无斑块形成。与对照组比较，模型组主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度明显增加，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度明显减少，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表2。

表2 3组主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

2.3 3组血脂水平比较 与对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C水平明显升高，HDL-C水平明显下降，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组TC、TG、LDL-C水平明显下降，HDL-C水平明显升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表3。

2.4 3组血清炎性因子比较 与对照组比较，模型组IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显降低(Plt;0.05)。见表4。

表3 3组血脂水平比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

表4 3组血清炎性因子比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

2.5 3组血清NO、MDA、SOD比较 与对照组比较，模型组MDA水平明显增加，NO、SOD水平明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组MDA水平明显降低，NO、SOD水平明显增加，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表5。

表5 3组血清NO、MDA、SOD比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

2.6 3组主动脉黏附分子表达比较 与对照组比较，模型组ICAM、VCAM、E-selection蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组ICAM、VCAM、E-selection蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表6。

表6 3组主动脉黏附分子表达比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

2.7 3组主动脉TLR3/TRIF信号通路相关分子表达比较 与对照组比较，模型组TLR3、TRIF、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(Plt;0.05)；与模型组比较，poly(I∶C)组TLR3、TRIF、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表7。

表7 3组主动脉TLR3/TRIF信号通路相关分子表达水平比较

注：与对照组比较,*Plt;0.05;与模型组比较,#Plt;0.05

3 讨论

目前，冠心病、脑缺血等心脑血管疾病的发病率逐年增加，致死率和致残率高，严重影响患者身心健康，而AS是导致上述疾病的主要原因。脂代谢紊乱是引起AS发生发展的主要因素，通过诱导炎性反应、损伤血管内皮等加速AS进程[10,11]。研究发现，采用高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠AS模型能够高度模拟人AS进程[12,13]。本研究结果显示，高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠14周后小鼠血脂水平明显升高，HE染色结果可见主动脉斑块形成和血管内-中膜厚度增加，提示造模成功，与以往研究[14]一致。

TLR3是广泛表达在免疫细胞、胰岛β细胞、神经细胞的跨膜信号转导受体。TLR3的配体主要为病毒来源的dsRNA及其类似物多聚肌胞苷酸poly(I∶C)，通过TRIF激活和募集下游信号分子，其中最关键的是与炎性反应相关的重要呈递分子MAPK系统(p38、JNK、ERK)，从而诱导IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子合成和释放[15]。Baiersdrfer等[16]研究发现，TLR3基因敲除小鼠主动脉斑块形成明显加快，提示TLR3在AS小鼠模型中发挥保护作用。这与之前发现的激活TLR3促进炎性因子释放和AS形成的观点矛盾。因此，TLR3在AS发生发展中似乎发挥双重作用。此外，TLR3参与AS形成的具体分子机制尚未阐明。

本研究结果发现，poly(I∶C)激活TLR3能够明显降低ApoE-/-小鼠TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，同时主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度明显减小(Plt;0.05)，说明poly(I∶C)能够有效降脂、延缓AS进程。此外，与模型组比较，poly(I∶C)组MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显降低，HDL-C、NO、SOD明显升高(Plt;0.05)，说明poly(I∶C)激活TLR3/TRIF通路通过抑制MAPKs家族磷酸化程度发挥抗炎作用，这可能是poly(I∶C)抗AS的机制之一。

综上所述，poly(I∶C)能够降低高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血脂水平，减小主动脉纤维帽厚度、血管内-中膜厚度，其机制可能与抑制MAPK信号通路中p38、JNK、ERK蛋白磷酸化及炎性反应有关。本研究为poly(I∶C)防治AS提供了新思路和新策略。

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EffectsofTLR3activator-poly(I∶C)onatheroscleroticplaqueformationinApoE-/-miceanditsmolecularmechanism

GENGRuili*,JINHe,ZHAOPei*,etal.

*DepartmentofClinicalLaboratory,HebeiProcincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effects of TLR3 activator-poly(I∶C)on atherosclerotic plaque formation in ApoE-/- mice and its molecular mechanism.MethodsA total of 10 specific pathogen free(SPF)male ApoE-/- mice were randomly divided into model group and poly(I∶C)group,with 5 mice in each group.The mice in model group and poly(I∶C)group were fed with high fat diet and high fat diet+poly (I∶C), respectively,and the other five C57BL/6J mice fed with normal diet C57BL/6J were served as control group.After 14-week feeding,all the mice were sacrificed,then the body weight,fiber-cap thickness,vascular intima-media thickness,TC,TG,LDL-C,HDL-C,NO,MDA,SOD,IL-6,IL-1β,TNF-α,VCAM-1,ICAM-1,P-selection and the expression levels of TLR3, TRIF,p-p38,p-JNK and p-ERK were observed and compared among the three groups.ResultsThe body weight in model group was significantly higher than that in control group(Plt;0.05),but there was no significant difference in body weight between model group and poly(I∶C)group (Pgt;0.05). No aortic plaque formation was found in control group, however, obvious aortic plaque formation and increase of vascular intima-media thickness were found in model group (Plt;0.05). As compared with those in model group,the aortic plaque formation and vascular intima-media thickness were significantly decreased in poly(I∶C)group (Plt;0.05). As compared with those in control group,the levels of TC,TG,LDL-C,MDA,IL-6,IL-1β,TNF-α,VCAM-1,ICAM-1,P-selection and the expression levels of TLR3,TRIF,p-p38,p-JNK,p-ERK proteins in model group were significantly increased,however, the levels of HDL-C,NO,SOD were significantly decreased (Plt;0.05). As compared with those in model group,the levels of TC,TG,LDL-C,MDA,IL-6,IL-1β,TNF-α and the expression levels of VCAM-1,ICAM-1,P-selection,TLR3,TRIF,p-p38,p-JNK,p-ERK proteins were significantly decreased in poly(I∶C)group,however, the levels of HDL-C, NO and SOD were significantly increased (Plt;0.05).ConclusionTLR3 activator-poly(I∶C)can inhibit atherogenesis and relieve AS lesion in ApoE-/- mice by inhibiting the activation of TLR3/TRIF signal pathway and decreasing inflammatory factors release.

Toll-like acceptor 3; atherosclerosis; ApoE genetic flaw

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.008

050051 石家庄市，河北省人民医院检验科(耿瑞丽、赵培、路永刚)；河北中医学院国际教育学院(金贺)

R 543

A

1002-7386(2017)24-3712-04

2017-06-19)