叶酸对阿霉素所致心肌损伤的保护作用研究

叶盛 夏武杰 张新民 陈鹏

叶酸对阿霉素所致心肌损伤的保护作用研究

叶盛 夏武杰 张新民 陈鹏

目的 探讨叶酸对阿霉素所致心肌损伤的保护作用。方法 将24只小鼠随机分成4组：对照组，叶酸组，阿霉素组，阿霉素+叶酸组，每组6只。阿霉素组：采用腹腔内注射阿霉素（每次2.5mg/kg，每周3次，共6次，总量15mg/kg），建立小鼠阿霉素心脏毒性模型，常规喂养4周；叶酸组：以等量0.9%氯化钠溶液代替阿霉素作腹腔内注射，并给予叶酸灌胃[10mg/（kg·d），共4周]；阿霉素+叶酸组：按上两组方法和剂量给予阿霉素和叶酸。对照组：以等量0.9%氯化钠溶液代替阿霉素做腹腔内注射，常规喂养4周。4周后B超测定小鼠心脏功能，TUNEL法测定小鼠心肌细胞凋亡率，并利用Western blot法分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果 阿霉素组各项心功能指标、心肌细胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值与对照组比较均有统计学差异（均P＜0.05）；而阿霉素+叶酸组各项心功能指标、心肌细胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值与阿霉素组比较均有明显改善（均P＜0.05）。结论 叶酸对小鼠阿霉素心肌损伤有明显的保护作用。

阿霉素 叶酸 心脏毒性

肿瘤化疗药物的发展尽管已经显著改变了许多恶性肿瘤的进程，但却可能导致心血管、血栓或代谢方面的并发症[1]。阿霉素是一种传统、有效、广泛应用于治疗实体肿瘤或者血液系统疾病的化疗药物,其具有一定的心脏毒性，可引起一系列的心脏损害症状，导致患者预后不良，再住院率及病死率升高。阿霉素的心脏毒性可导致心肌病变，因而使其使用剂量和疗程收到限制。叶酸具有间接抗氧化、降低活性氧物质生成、稳定DNA、抗心肌细胞凋亡及改善线粒体功能的作用，而这些作用正是对抗阿霉素心脏毒性的可能作用机制[2-9]。对此我们进一步开展了动物实验，以探讨叶酸对阿霉素所致心肌损伤的保护作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠24只，均为雄性，体重22~26g，由温州医科大学实验动物中心提供，所作研究经温州医科大学实验动物委员会批准。

1.2 主要试剂 阿霉素由深圳万乐药业有限公司提供；叶酸由天津力生制药有限公司提供；TUNEL试剂盒购自瑞士Roche Molecular Biochemicals公司；Bax、Bcl-2、GAPDH抗体购自美国SantaCruz公司。

1.3 分组和方法 24只小鼠按随机数字表法分成4组，每组6只。阿霉素组：采用腹腔内注射阿霉素（每次2.5mg/kg，每周 3次，共 6次，总量 15mg/kg），建立小鼠阿霉素心脏毒性模型，常规喂养4周；叶酸组：以等量0.9%氯化钠溶液代替阿霉素作腹腔内注射，并给予叶酸灌胃[10mg/（kg·d），共4周]；阿霉素+叶酸组：按上两组方法和剂量给予阿霉素和叶酸。对照组：以等量0.9%氯化钠溶液代替阿霉素作腹腔内注射，常规喂养4周。

1.4 心脏超声检测各组小鼠心功能情况 4周后小鼠称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，充分暴露前胸部，用8%硫化钠脱去前胸部的毛。测量左室舒张末期内径（LVEDD）和左室舒张末期容积（LVEDV），并计算左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）。所有检测指标取3个连续心动周期的平均值，测量工作均由有经验的超声科医师在同一彩超仪上完成。

1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明书，取各组小鼠左心室心肌组织作石蜡切片，依次予以脱水、染色，利用寡核苷酸末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记凋亡的心肌细胞，最后荧光显微镜下观察阳性心肌细胞并计算心肌细胞凋亡百分率（每张切片选取10个不重复视野（×100倍），细胞核呈绿色荧光为阳性细胞，计算阳性细胞数和细胞总数的比值）。

1.6 Western blot法检测凋亡相关蛋白表达水平 4周后取小鼠左心室心肌组织液氮碾磨，加入裂解液，匀浆离心后取上清液以BCA法测定蛋白浓度。取各组蛋白60μg，以10%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，电转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 37℃封闭1h，加入一抗 Bax、Bcl-2（1∶1 000）多克隆抗体，以 GAPDH 作为内参照标化Bax、Bcl-2蛋白表达。4℃冰箱孵育过夜，TBST 洗涤 3次，加入二抗（HRP标记 IgG，1∶1 000），室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光法显色，曝光、显影、定影。胶片扫描后用Quantity One凝胶成像分析系统进行半定量分析。

图1 各组小鼠心肌细胞凋亡的比较（TUNEL染色法）

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，测得计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 周后各组小鼠心功能的比较 见表1。

表1 4周后各组小鼠心功能的比较

由表1可见，阿霉素组LVEDD、LVEDV较对照组明显升高，而LVEF、LVFS较对照组明显降低（均P＜0.05）；而阿霉素+叶酸组各项心功能指标与阿霉素组比较均有明显改善（均P＜0.05）。2.2 叶酸对阿霉素致小鼠心肌细胞凋亡的影响 TUNEL染色显示，对照组及叶酸组中未见凋亡心肌细胞，阿霉素组可见大量凋亡心肌细胞（绿色荧光），阿霉素+叶酸组可见少量凋亡心肌细胞，见图1。结果显示,与对照组相比，阿霉素组心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），而阿霉素+叶酸组心肌细胞凋亡率与阿霉素组比较有明显降低（P＜0.05），见图 2。

图2 各组小鼠心肌细胞凋亡率的比较（注：与对照组比较，*P＜0.05；与阿霉素组比较，△P＜0.05）

2.3 叶酸对阿霉素致小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Bax、Bcl-2各组之间的相对表达量见图3。各组组间比较显示，阿霉素组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比

图3 各组小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的比较（电泳图）

3 讨论

对于阿霉素所致的心脏毒性及其机制的研究已持续了数十年。尽管近年来有许多不同的研究结果均显示阿霉素可导致不同程度的心脏损害，但是其潜在机制却尚未明确。阿霉素所致心脏毒性在患者治疗恶性肿瘤的同时却又带来了心血管疾病风险，增加病死率及再住院率，严重影响肿瘤患者的预后，也同时限制了阿霉素作为抗肿瘤药物的应用。

如果能够在化疗初始或早期阶段针对阿霉素所致心脏毒性进行干预，减少自由基及线粒体损伤，降低心肌细胞凋亡，那么将为广大肿瘤患者带来福音。目前已有多种药物被证实可用于治疗阿霉素所致的心脏毒性，如抗氧化剂H2S[10]。另外，细胞因子促红细胞生成素及集落刺激因子可以拮抗阿霉素导致的心肌细胞MHC、Troponin I和Desmin 3种蛋白表达的下降，减少炎症介质如CD45的表达，从而减轻阿霉素所致的心肌细胞萎缩和心肌纤维化，显著增强阿霉素所致心肌损伤小鼠的左心室收缩功能，发挥显著的保护作用[11-12]。临床应用广泛的卡维地洛是一种肾上腺素受体阻断药，目前发现其兼有抗氧化活性，能阻止阿霉素诱导的活性氧产生和细胞凋亡，对阿霉素所致的心肌损伤发挥显著的保护作用[13]，然而卡维地洛作为一种β受体阻滞剂，若应用于本身无心血管疾病的肿瘤患者却可能带来低血压、心率减慢等不良反应。因此我们亟需发现一种临床应用广泛，对肿瘤患者的血流动力学影响小，经济费用低的药物来抑制阿霉素引起的心脏毒性。

近年研究表明，叶酸的缺乏与心血管疾病的发生存在着密切的关系。其在治疗心血管疾病的机制可能源于其使同型半胱氨酸向蛋氨酸转化有关[14]。当叶酸摄入不足或者代谢通路受干扰的时候,可影响细胞DNA正常值较对照组明显升高（P＜0.05）；而而阿霉素+叶酸组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值较阿霉素组明显下调（P＜0.05），见图 4。合成，也可使得体内同型半胱氨酸水平升高。多项研究表明，叶酸具有间接抗氧化、降低活性氧物质生成、稳定DNA、抗心肌细胞凋亡及改善线粒体功能的作用。

图4 各组小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值的比较（注：与对照组比较，*P＜0.05；与阿霉素组比较，△P＜0.05）

本研究结果显示，叶酸能抑制阿霉素所致的心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白BAX/BCL-2的表达，改善小鼠心脏功能，对阿霉素所致的心脏损伤具有显著地保护作用；且叶酸临床容易获得，价格低廉，药物不良反应小，值得在临床上推广使用，但其对使用阿霉素治疗肿瘤患者的心功能有何影响，尚需进一步研究。

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Folic acid protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity

YE Sheng，XIA Wujie，ZHANG Xinming，et al.Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the protective effects of folic acid(FA)in the pathogenesis of doxorubicin(DOX)-induced cardiotoxicity. Methods Twenty four mice were randomly divided into 4 groups:control group,folic acid group,doxorubicin group and doxorubicin+folic acid group with 6 mice in each group.Mice in doxorubicin group

doxorubicin(2.5 mg/kg,i.p,3/wk for 2 wks,);mice in folic acid group received FA 10 mg/d by gavage for 4 wks;mice in doxorubicin+folic acid group received FA10 mg/d by gavage from the day of DOX administration for 4 wks;mice in control group received injections of saline.After 4 weeks,left ventricular(LV)function was measured by echocardiography,cardiomyocyte apoptosis were assessed by TUNEL staining;the expression of bax/bcl-2 was detected by Western blot. Results Doxorubicin induced left ventricular dysfunction and remolding(P＜0.05),increased cardiomyocyte apoptosis(P＜0.05),and up-regulated of bax/bcl-2 levels(P＜0.05).FA ameliorated DOX-induced left ventricular dysfunction and remolding(P＜0.05),attenuated cardiomyocyte apoptosis(P＜0.05),and down-regulated bax/bcl-2 expression(P＜0.05). Conclusion Folic acid has a protective effect against DOX-induced cardiotoxicity in mice.

doxorubicin(DOX) folic acid(FA) cardiotoxicity

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2017-2010

325027 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学育英儿童医院心血管内科

叶盛，E-mail：YVLX88227737@163.com

2017-08-22）（本文编辑：沈昱平）