碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌筛选及临床分析

许光辉，陈淑娟，俞柳敏，涂海健

（莆田学院附属医院检验科，福建 莆田 351100）

碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌筛选及临床分析

许光辉，陈淑娟，俞柳敏，涂海健

（莆田学院附属医院检验科，福建 莆田 351100）

目的 筛选碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（CRKP）及现状分析。方法 采用K-B法及配套GN卡上机鉴定、改良Hodge法试验、EDTA纸片协同试验筛选碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。结果 2015年7月～2016年12月，本院临床科室送检标本分离碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株36株。结果表明，碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌院内尤其是重症医学科病房感染严重，其多重耐药现象突出。结论 建议开展其同源性分析及监测肺炎克雷伯菌流行情况，应引起医院高度重视。

碳青霉烯酶；耐药性；肺炎克雷伯菌；医院感染；筛选；分析

碳青霉烯类抗生素是治疗产ESBLs菌株、头孢菌素酶（AmpC酶）肺炎克雷伯菌所致感染的常用药物[1]。1年来，本院从临床送检各种标本筛选碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株，并通过WHONET 5.6软件对其耐药情况分析，收集标本便于课题组后续肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类膜孔蛋白基因、同源性分析、耐药基因、质粒介导的耐药传播性等研究，最终为临床提供合理用药信息。

1 材料与方法

1.1 临床菌株 自2015年7月～2016年12月，收集由本院临床标本送检微生物实验室分离的碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株36株。肺泡灌洗液15株、痰液11株、血液3株、尿液5株、脑脊液1株、各类导管液1株。标本来源分别为重症医学科15例、呼吸内科6例、神经内科2例、神经外科5例、心胸外科3例、肾内科2例、内分泌科1例、泌尿外科2例。

1.2 标准菌株 大肠埃希菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、产碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（ATCCBAA-1705）、非产碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（ATCCBAA-1706）购于卫生部临床检验中心。

1.3 仪器 法国梅里埃Vitek2-Compact微生物鉴定系统、LEICA显微镜、瓶口分配器（德国BRAND）。

1.4 试剂 配套GN鉴定卡和药敏卡（法国梅里埃生物公司）、M-H琼脂、血琼脂与巧克力培养基（山东百博生物公司）、药敏纸片（英国OXOID公司）、革染氏染液（法国BASO公司）、氧化酶试剂（英国OXOID公司）。

1.5 菌株分离鉴定与药敏试验 采用分区划线法接种于血琼脂与巧克力培养基35℃培养18～24 h后，分离疑似菌落，经革兰氏染色后镜检呈G-杆菌，氧化酶试验呈阴性，再经Vitek2-Compact微生物鉴定系统。米诺环素、多粘菌素B、舒普深采用纸片扩散K-B法试验。结果判读依CLSI文件执行[2]。

1.6 改良Hodge法试验 配制0.5麦氏单位大肠埃希菌（ATCC25922）悬液，用灭菌生理盐水按1∶10将悬液再稀释。用无菌棉签将稀释好的菌悬液在M-H琼脂平板上均匀涂布后待干燥3～5 min，将美罗培南纸片（30μg/片）置于平板中央处，用无菌接种环挑取待测菌落从垂直于美罗培南纸片边缘划线约20～25 mm，35℃培养16～20 h。

1.7 EDTA纸片协同试验 配制0.5麦氏单位待测菌株悬液并均匀涂布于M-H琼脂平板上，按K-B法贴美罗培南纸片（30μg/片），并在其边缘约10～15 mm处贴无菌空白纸片，再滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10μL，置35℃培养16～20 h。1.8 统计学方法 采用WHONET 5.6软件统计学分析数据。

2 结果

2.1 碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（K-B法）耐药情况 碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株所有的ESBL全部报阴性。无论是否加酶抑制剂，都是耐药，看不到酶抑制剂的抑制效果。但是表型ESBL阳性的确证需要有加酶抑制剂的抑制，见表1。

表1 耐碳青霉烯类抗生素KPN耐药情况Table 1 KPN resistance of carbapene-resistant antibiotics

2.2 改良Hodge试验 使用改良Hodge试验（MHT）全部阳性，筛选碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株，见图1。

图1 改良Hodge试验阳性为产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Figure 1 Modified Hodge test positive for producing carbon penicillium enzyme klebsiella bacteria pneumonia

2.3 EDTA纸片协同试验 依据碳青霉烯酶可被EDTA抑制的特性，通过EDTA纸片协同试验，两张纸片间有协同作用可视为该菌产生碳青霉烯酶阳性[3]。碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌36株仅筛选产金属酶1菌株，见图2。

图2 EDTA纸片协同试验阳性为产金属酶肺炎克雷伯菌Figure 2 EDTApaper was tested positive for metalloenzyme pneumonia klebsiella pneumoniae

2.4 通过WHONET数量，已剔除重复菌株，本院2014年～2017年碳青霉烯酶肺炎克雷伯（CRKP）发生率，见表2。

表2 本院2014年～2017年碳青霉烯酶肺炎克雷伯（CRKP）发生率Table 2 The incidence of carbapenylase pneumonia(CRKP)in the hospital from 2014 to 2017

3 讨论

碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株的出现，造成了患者病程迁延和临床抗生素治疗的失败，从而增加了患者的医疗费用和病死率[4]。

本院微生物实验室近段时间共筛检耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）36株，重症医学科筛检15例，呼吸科6例次之，来源于多学科，尤其是重症医学科病房患者多有严重基础性疾病，接受广谱抗菌药物治疗，已成为多重耐药菌的主要人群，应重视病房隔离、控制，加强手卫生，建立一套完整感染防控机制，防止CRKP感染。标本类别肺泡灌洗液15株最多，也有血液、脑脊液、各类导管液等，基本上各类标本都检出。这些CRKP菌株体外活性试验显示，其不但对青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、呋喃类耐药（舒普深耐药95.2%），仅只对四环素类、多黏菌素类全敏感，是多重耐药菌，而且对亚胺培南耐药，ESBL全部阴性，确定是否产ESBL还必须通过基因检测确认[5]。本课题组已报道29株耐碳青霉烯类抗生素KPN菌还检测出携带编码产β-内酰胺酶的blaTEM、blaSHV基因，其中18株同时检出ampC酶基因，29株均检出喹诺酮类耐药相关gyrA、parC基因[6]。

使用改良Hodge试验（MHT）全部阳性，初筛产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株。这与孙红等[7]改良Hodge试验报道一致。目前CLSI推荐检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型方法是改良Hodge试验,但实验比较繁琐。后续采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析耐药菌株同源性、实时荧光PCR检测膜孔蛋白基因表达高低、质粒介导的AmpC酶，以及是否与头孢西丁耐药等科研团队相继立项开展研究。

碳青霉烯酶分为两类，金属酶和非金属碳青霉烯酶，非金属碳青霉烯酶命名为KPC-1，可被克拉维酸抑制，不被EDTA所抑制[8]。金属酶可被EDTA所抑制，应用EDTA纸片协同试验区分。其中金属酶因不被临床常用酶抑制剂所抑制，造成更大的威胁。准确筛选碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染及确定耐药菌的主要耐药基因型，结合同源性分析，对合理使用抗生素，增强疗效有重要意义。

通过WHONET 5.6软件对本院临床科室送检标本产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌统计，并剔除重复菌株，2014年～2017年产碳青霉烯酶肺炎克雷伯（KPC）发生率从2.4%陡增到18.2%，甚至2017第1季度已达到14.5%，这与卫生部全国细菌耐药监测网（CARSS）数据显示2015年我国CRKP发生率为7.6%[8]有较大差异性，应引起医院管理者足够重视。

[1] Nordmann P,Cuzon G,naas T.The real threat of Klebsiella pneumoiae carbapenemase-producing bacteria[J].Lancet Infect Dis,2009,9:228-236.

[2] Shen P,Wei Z,Jjiang Y,et al.Novel genetic environment of the xarbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-2 among Enterobacteriaceae in China[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53:4333-4338.

[3] Giakkoupi P,Vourli S,Polenlis M,et al.Supplementation ofgrowm media with Zn2+facilitates detection of VIM-2 producillg Pseudomonas aeruginosa[J].Clin Microbiol,2008,46(4):1568-1569.

[4] 刘军,赵祖国,曾涛,等.主动外排系统AcrAB-TolC与肺炎克雷伯菌耐性关系研究[J].中国病原生物学杂志,2013,8(1):35-38,70.

[5] 赵晓杰,康海全,姜飞,等.KPC-2基因和外膜蛋白介导的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药机制分析[J].中国病原生物学杂志,2015,10(3):211-214.

[6] 涂海健,陈淑娟,林群英,等.耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药基因检测及分析[J].分子诊断与治疗杂志,2016,8(4):246-251.

[7] 孙红,郭普,钟政荣,等.对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌KPC基因型分析[J].蚌埠医学院学报,2012,37(10):1232-1234.

[8] 代强,郑波.2012美国疾病预防控制中心耐碳青霉烯类肠杆菌控制指南简介[J/CD].中国医学前沿杂志(电子版),2013,5(8):30-31.

Screening and clinical analysis of Carbapenem producing Klebsiella pneumoniae

Xu Guang-hui,Chen Shu-juan,Yu Liu-min,Tu Hai-jian
(Laboratory Department,TheAffiliated Hospital of Putian,Putian,Fujian,351100,China)

Objective The analysis of CRKP and the status quo of carbapenylase pneumonia were screened.Methods The k-b method and the matching GN card were used for identification,Improved Hodge test,EDTA paper was used to screen for pneumocyrene pneumoniae.Results From July 2015 to December 2016,there were 36 strains of klebsiella pneumoniae in the clinical department of the hospital.The results indicate that the severe infection in the patients with the carbapenase pneumonia klebsiella pneumoniae,especially in the icu.It`s multiple drug resistance is outstanding.Conclusion The homologous analysis and the monitoring of klebsiella pneumoniae were recommended.The hospital should be highly regarded.

Carbapenase;Drug resistance;Klebsiella pneumoniae;Hospital infection;Screening;Analysis

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.003

莆田学院校内科研项目（2014032）通讯作者：许光辉，E-mail:xgh3089@126.com