响应面优化微波辅助提取珊瑚菌多糖工艺研究

徐兵，王喆，冯琳（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

响应面优化微波辅助提取珊瑚菌多糖工艺研究

徐兵，王喆，冯琳（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

研究采用虞山的珊瑚菌作为试验材料，应用微波辅助提取改进珊瑚菌多糖的工艺参数。首先以珊瑚菌多糖得率作为指标，进行单因素试验，探究提取时间、微波功率以及液料比对其影响。在单因素试验基础上，通过响应面试验设计并结合响应面法来改进微波提取珊瑚菌多糖工艺，得出优化后的提取参数：微波功率410 W、提取时间8 min、液料比33∶1（mL/g），珊瑚菌多糖得率为7.01%。

珊瑚菌多糖；微波辅助提取；响应曲面法

珊瑚菌（Ramariabotrytoides）是一种子实体接近珊瑚状的陆生真菌，属于伞菌目。珊瑚菌科各属中有很多食药兼备可食用菌类[1-2]。珊瑚菌作为食用菌界的奇葩，具有数十种氨基酸、维生素以及微量元素，是天然的功能性食品[3-4]。常正尧、齐冰的研究表明，珊瑚菌多糖具有抑制乳腺癌细胞生长的作用，同时也有文献表明，该菌多糖具有抗氧化的生理活性，故珊瑚菌多糖颇具开发前景[5-6]。多糖提取的传统方法包括热水提取法[7]、酶催化法[8]和碱提法[9]等。能耗高，耗时长且得率较低是这些方法的通病。近些年，微波和超声波辅助提取在多糖提取逐渐流行，因为微波法对提取物的结构破坏较少，从而效果好且提取率较高[10-11]。现如今，尚未有微波用于珊瑚菌多糖提取的研究，故利用单因素及响应面法优化提取珊瑚菌多糖的工艺，可为其进一步利用和研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料和试剂

珊瑚菌：采自虞山国家森林公园；葡萄糖、浓硫酸、乙醚、乙醇、重蒸苯酚等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

α-1900PCS双光束紫外可见分光光度计：谱元仪器有限公司；WL 2S-1型微波萃取仪：南京苏恩瑞微波设备；TG16-WS台式高速离心机：上海申安医疗器械厂；M124A型电子天平：BEL；MJ-BL25C3型搅拌机：广东美的电器制造有限公司；LGJ-10冷冻干燥仪：赛飞（中国）有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 珊瑚菌的预处理

用蒸馏水将珊瑚菌洗净，在65℃恒温干燥箱内烘干。搅拌机粉碎过65目筛，再用95%乙醇回流两次除去部分脂溶性杂质，得到预处理珊瑚菌粉[12-13]。

1.3.2 标准曲线的测定

用干燥的葡萄糖标准品配置浓度为0.04 mg/mL的标准溶液，移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于试管中，补齐至2 mL。在各管滴加1 mL 6%重蒸苯酚溶液，尽快滴入5 mL浓硫酸摇匀并静置，等待5 min后50℃保持15 min，充分冷却。用490 nm波长检测不同标样的吸光度。以葡萄糖标准品浓度（μg/mL）做自变量，吸光度做因变量，得标准曲线：y=0.014 38+0.026，R2=0.999 1。

1.3.3 珊瑚菌多糖的微波辅助提取

准确称量珊瑚菌粉末样品，提取介质选用蒸馏水，在不同提取时间、微波功率和液料比条件下提取2次，冷却离心合并滤液，而后进行减压浓缩。加入无水乙醇，使溶液含醇量85%，放置1 d。再以5 000 r/min离心15 min，最后经无水乙醇洗涤沉淀，冻干后得到珊瑚菌多糖。

1.3.4 珊瑚菌多糖纯度以及得率计算

选用苯酚-硫酸法来测定珊瑚菌多糖含量[14-15]。

1.3.5 单因素试验

试验以蒸馏水作溶剂，探究不同提取时间，液料比以及微波功率对珊瑚菌多糖得率的影响。再以1.3.3中提取及得率计算方法测出不同条件下珊瑚菌多糖得率。

1.3.5.1 提取时间对珊瑚菌多糖得率的影响

按时间将试验分为 5 组：4、6、8、10、12 min，做 2 次平行。试验固定液料比30∶1（mL/g），微波功率400 W。

1.3.5.2 提取功率对珊瑚菌多糖得率的影响

设定提取时间 8 min，液料比 30∶1（mL/g），考察珊瑚菌多糖在功率 200、300、400、500、600 W 时得率的变化。

1.3.5.3 液料比对珊瑚菌多糖的影响

在使用液料总体积不变的情况下，按液料比不同，试验划分为 5 组：15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）。试验提取8 min，微波功率400 W，并做3次平行试验。

1.3.6 响应面试验设计

响应面法在工程应用、理化试验、生物科学及食品科学等诸多领域有着深入的应用[16-17]。Box-Behnken Design（BBD）是广泛应用的一种探究最佳工艺参数的设计方法[18-19]。该试验中，设计三水平三因素试验方案见表1所示，探究珊瑚菌多糖微波辅助提取的优化提取参数。

表1 试验编码和试验参数对照关系Table 1 The comparison relationship between encode and actual concentration of factor

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 提取时间对珊瑚菌多糖提取率的影响

微波提取时间对珊瑚菌多糖的得率的影响见图1。

图1 微波提取时间对珊瑚菌多糖的得率的影响Fig.1 Effects of microwave-assisted time on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

从图1可见，在微波提取时间由4 min上升至8 min过程中，珊瑚菌多糖得率出现跃变，并在达到最大值。而之后，伴随提取时间延长，多糖得率出现下降。因此，选择较优提取时间8 min，提取率为6.94%。

2.1.2 微波功率对珊瑚菌多糖提取率造成的影响

微波提取功率对珊瑚菌多糖提取率的影响见图2。

从图2可以看出，在微波处理功率从200 W提至400 W时，珊瑚菌多糖提取得率变化幅度很大，并在400 W时出现最大值，而后提取功率进一步增大时，得率逐渐下降。这可能是因为先是微波促进细胞壁破碎而后随功率增大，温度提升过快反而破坏多糖结构。在此条件下较佳提取功率400 W，得率6.98%。

图2 微波提取功率对珊瑚菌多糖提取率的影响Fig.2 Influence of microwave power on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

2.1.3 液料比对珊瑚菌多糖提取率的影响

液固比对珊瑚菌多糖提取率的影响见图3。

图3 液固比对珊瑚菌多糖提取率的影响Fig.3 Influence of material-to-liquid ratio on the extraction rate of the Ramariabotrytoides polysaccharide

由图 3可见，液料比从 15∶1（mL/g）提升至 30∶1（mL/g）过程中，珊瑚菌多糖得率变化明显。这可能是由于液料比过低使珊瑚菌粉没有充分分散于介质中而降低提取率。在液料比达到30∶1（mL/g）后，多糖得率趋于稳定。因此选择30∶1（mL/g）作为珊瑚菌多糖提取的较佳液料比，得率6.92%。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果

试验应用Design-Expert8.06Trial软件进行试验数据处理，进组合试验结果见表2。

在这17组数据中，有12个析因点和5个用于估算误差的零点。

表2 Box-Behnken试验设计以及珊瑚菌多糖提取结果Table 2 Design and responses values of Box-Behnken design

2.2.2 方差分析结果

珊瑚菌多糖得率的方差分析见表3。

表3 珊瑚菌多糖得率的方差分析Table 3 The variance analysis result of Ramariabotrytoides polysaccharide yield

运用design-expert软件对表2中的数据做出处理，经多元回归拟合，计算出珊瑚菌多糖得率回归方程式：

由表3分析可得，该模型的P值<0.01，说明本试验模型具有统计学意义；失拟项P值为0.410 1，显示数学模型和实际试验值拟合度很好，从而回归方程可近似代替试验真实点。此外，模型中一次项X2、X3，二次项 X12、X22、X32以及交互项 X1X2的 P 值都＜0.05，说明本试验的各个因子以及因子间的交叉作用都对多糖得率有显著影响。同时注意到在单因素中，对珊瑚菌多糖提取率变化贡献大小为微波功率＞提取时间＞液料比。

2.2.3 珊瑚菌多糖得率的响应面优化

通过回归模型，可以得到任意两个选定因子以及其交叉作用对珊瑚菌多糖提取率的相应等高线图和响应面见图4～图6。

图4 提取时间和微波功率对珊瑚菌多糖得率的交叉效应的响应面图和等高线Fig.4 Microwave treatment time and microwave power on the interaction polysaccharide yield of a response surface plot and contour lines

图5 液料比和提取时间对珊瑚菌多糖提取率的交叉效应的响应面图和等高线Fig.5 Liquid ratio and microwave treatment time on the interaction polysaccharide yield of a response surface plot and contour lines

图6 液料比和微波功率对珊瑚菌多糖提取率的交叉效应的响应面图和等高线Fig.6 Response surface plot and contour lines of the interaction of liquid-material ratio and microwave power on the polysaccharide yield response surface plot and contour lines

从图4可以看出，在固定液料比30∶1（mL/g）的情况下，珊瑚菌多糖得率随时间变化并不明显。反观纵坐标方向，随着微波功率的变化多糖得率变化很明显。同时看到等高线为椭圆形，说明这两个因子之间交叉影响作用非常显著。

从图5可以看出，在固定微波功率400 W的情况下，液料比因素与提取时间因素对多糖得率变化的影响基本相同。同时注意到随着液料比的增加及提取时间的延长，得率又一个先增大后减小的过程。

从图6观察得，在固定提取时间8 min时，多糖得率随液料比变化不明显，而随微波功率从300 W提升至400 W是，其先起后伏的变化明显。

通过design-expert软件分析，可得珊瑚菌多糖提取工艺的最优解：既微波功率407 W，提取时间8 min，液料比 33∶1（mL/g），得率 7.12%。参考实际条件，确定实际操作的最优方案：微波功率410 W，提取时间8 min，液料比 33∶1（mL/g）。经过 3次平行试验，测得实际多糖提取率7.01%，这与理论值的相差在2%以下。由此可见，应用响应面法改进微波辅助提取珊瑚菌多糖是可行的，具有应用于实际生产的价值。

3 结论

微波辅助提取采用于珊瑚菌多糖，使提取变得高效而节能。试验采用Design expert 8.0.6 Trial软件设计试验，通过响应面分析得到提取率与提取时间、微波功率及液料比因素的模型方程。相比较，李华等[20]使用单因素和正交试验优化提取工艺，通过用热水浸提的试验方法得出结论：珊瑚菌的最佳提取条件为浸提温度为 90℃、浸提时间 2 h、液料比 20 ∶1（mL/g），粗多糖平均得率为5.64%；朱晓娟等[21]使用超声波辅助提取法的最佳工艺参数为超声功率108 W、液料比25∶1（mL/g）、超声时间45 min、提取4次，在此条件下，珊瑚菌多糖得率为6.86%。而本试验得出珊瑚菌多糖提取工艺的最优解：既微波功率410 W，提取时间8 min，液料比33∶1（mL/g），得率 7.01%。由此可见，微波辅助提取法行之有效的提高了珊瑚菌多糖的得率。

[1]卯晓岚．食用珊瑚菌[J].中国食用菌,1987(1):22

[2]李仲贤.秦巴山区野生珍稀珊瑚菌分离培养研究[J].陕西农业科学,2013(3):54-55

[3]王法云,崔波,古奕庆,等．河南的珊瑚菌科食用菌资源研究及开发利用[J].河南科学,1997,15(1):57-64

[4]Kavishree S,Hemavathy J,Lokesh B R,et al.Fat and fatty acids ofIndian edible mushrooms[J].Food Chemistry,2008,106(2):597-602

[5]常正尧,吴亚楠,李永芳,等.珊瑚菌抗乳腺癌作用的研究[J].时珍国医国药,2013(1):152-154

[6]王丽娟,张飞,苗玉洁.珊瑚菌多糖的提取及其对羟自由基的清除作用研究[J].食品工业,2012(10):43-46

[7]Lalaoui,K Satta,D.Immunostimulating activity of the hot water-soluble polysaccharide extracts of Anacyclus pyrethrum,Alpiniagalanga and Citrulluscolocynthis[J].Journal of Ethnopharmacology,2003,88(2/3):155-160

[8]陈炼红,杨丽珠,索化夷,等.响应面法优化松茸多糖酶法提取工艺及其体外抗氧化性分析[J].食品科学,2014(16):23-28

[9]曹湛慧,刘亚,黄和,等.碱法提取淮山多糖及其体外抗氧化活性的研究[J].食品工业,2015(2):25-28

[10]朱彩平,高贵田,李建科,等.响应曲面法优化微波辅助提取平菇多糖工艺研究[J].食品科学,2010(4):68-72

[11]陈晓青,刘覃,蒋新宇,等.Microwave-assisted extraction of polysaccharides from solanumnigrum[J].Journal of Central South University of Technology(English Edition),2005(5):556-560

[12]盛家荣,欧阳逊,邓秋波,等.南板蓝根多糖提取的最佳脱脂工艺[J].中药材,2007(1):99-101

[13]张斌,张璐,李沙沙,等.均匀设计法研究甘蔗渣多糖提取的最佳脱脂工艺[J].时珍国医国药,2012(7):1713-1714

[14]刘玲,陶松,应萍,等.苯酚硫酸法测补肾口服液中多糖含量及其不确定度评价[J].江西中医学院学报,2013(3):38-41

[15]Xu Xiu-quan,Yu Rong-min,Liu ke,et al.Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from RHIZOMA AREACTYLODIS LANCEAE by Response Surface Methodology[J].Medicinal Plant,2011(5):67-70

[16]李莉,张赛,何强,胡学斌.响应面法在试验设计与优化中的应用[J].试验室研究与探索,2015(8):41-45

[17]王晓阳,唐琳,赵垒.响应面法优化刺槐花多酚的超声提取工艺[J].食品科学,2011(2):66-70

[18]Yang Shangying,Li Ying,Jia Dongyin,et al.The synergy of Box-Behnken designs on the optimization of polysaccharide extraction from mulberry leaves[J].Industrial Crops&Products,2017,99:70-78

[19]吴美媛,王喜周,余甜女,等.Box-Behnken效应面法优化微波提取猴头菇多糖工艺[J].食品研究与开发,2014(9):23-26,35

[20]李华,窦晓兰,陆启玉.葡萄状枝瑚菌粗多糖的提取及其清除DPPH自由基活性[J].食用菌学报,2012(3):69-72

[21]朱晓娟,郑国栋.超声法优化提取珊瑚菌多糖的工艺研究[J].食品研究与开发,2016(18):45-48

Study on the Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides from Ramariabotrytoides by Response Surface Methodology

XU Bing，WANG Zhe，FENG Lin
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

This article used Ramariabotrytoides which from YuShan as experimental material.Microwave assisted method was used to improve extraction technology of polysaccharides.The extraction rate was set as evaluation index，and some single factors（material liquid ratio，exaction time，and microwave power.）were studied.And on this base，Box-Behnken Design（BBD）and response surface methodology（RSM）were used to design experiments for optimization of extraction technology of polysaccharides from Ramariabotrytoides.Results showed that material-liquid ratio 33∶1（mL/g），microwave time 8 min with microwave power 410 W were the optimum extraction parameters.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharide from Ramariabotrytoides was 7.01%.

Ramariabotrytoides polysaccharides；microwave-assisted extraction （MAE）；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.014

苏州市科技计划项目（SNG201615）

徐兵（1982—），男（汉），实验师，硕士，研究方向：食用菌学。

2017-05-11