鸡肉和猪肉蛋白质酶解动力学及产物性质分析

张汆，陈志宏，陈静，袁怀波

（1.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239000；2.合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽合肥230009）

鸡肉和猪肉蛋白质酶解动力学及产物性质分析

张汆1，陈志宏1，陈静1，袁怀波2

（1.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239000；2.合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽合肥230009）

采用体外模拟方法，对两种蛋白的消化动力学及其产物抗氧化活性进行了分析。结果显示，鸡肉蛋白更容易被蛋白酶所水解，生成更多的游离氨基酸和非蛋白氮（NPN），具有较低的Km值和较高的Vmax。体外抗氧化活性结果显示，经胃液、肠液消化后，两种蛋白消化产物的抗氧化活性显著增强（p≤0.01），且差异显著（p≤0.01），除脂质过氧化抑制活性外，鸡肉蛋白消化产物显示出更强的体外抗氧化活性。研究表明，不同膳食蛋白具有不同的消化动力学性质，其产物具有不同抗氧化活性。

鸡肉蛋白；猪肉蛋白；消化动力学；消化产物；抗氧化活性

不同来源的蛋白质，显示不同的营养性质。现代动物营养学研究表明，不同来源的膳食蛋白对机体的影响是多方面的，如，降低血清胆固醇含量[1-2]、影响骨矿物质密度和吸收[3]、影响动物蛋白酶的分泌并因此影响蛋白质的消化[4]、影响动物脂类的代谢[5-6]等。JukkaMontonen等[7]研究发现，动物蛋白和植物蛋白对动物血清中与糖代谢、氧化压力、炎症和肥胖相关的生理指标也会产生不同的影响。

传统蛋白质营养学认为，膳食蛋白营养价值的高低一般取决于其氨基酸组成和生物可利用率[8]。但当采用具有相似氨基酸组成的蛋白质和氨基酸配方饲喂动物时，并不能获得相似的生长结果，后者的生长状况往往更差些[9]。直到1902年在动物胃肠中发现了活性肽[10]，随后展开的大量研究表明，蛋白质经消化道水解后，主要以2个～3个氨基酸组成的寡肽形式被吸收，并能直接参与蛋白质的合成[11]。这些寡肽是一类具有特殊生理功能的肽类物质——活性肽。现已证明，活性肽在人的生长发育、新陈代谢、疾病以及衰老、死亡的过程中起着关键作用，与人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢密切相关[12-13]。当蛋白质在消化道中以肽的形式水解时，更有利于氨基酸吸收[14]。从寡肽释放量看，不同来源蛋白质间存在差异。动物采食鸡蛋蛋白和α-乳清蛋白后空肠滤液中肽含量比采食小麦谷蛋白和玉米蛋白粉高。体外酶解实验也表明，动物蛋白质的寡肽释放量比豆科植物蛋白质高，谷物饲料最少[15]。

越来越多的研究显示，不同来源蛋白质营养学差异的主要原因可能在于其分子酶解期间产生的多肽不同、或释放多肽的速度不同。为了解不同来源动物蛋白在体内的消化过程及产物差异性，本文采用体外模拟方法对鸡肉和猪肉蛋白酶解动力学及产物的体外抗氧化活性进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜鸡胸肉、猪背最长肌：滁州市三里亭菜市场。手工剔除脂肪、结缔组织后，绞碎，备用。

1.2 仪器设备与试剂

HH-4数式恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；L550低速自动平衡离心机：长沙湘仪离心机有限公司；玻璃仪器气流烘干器、SXJQ-1型数显直流无极调速搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；CP224s型电子分析天平：Sartorius，德国赛多利斯集团；PHSJ-3F实验室PH计：上海精密科学仪器有限公司；KDN-102F自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司；721型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

DPPH·（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，1，1-Dipheny 1-2-Picrylhydrazyl Free Radical），纯度＞97.0%：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；胃蛋白酶（酶活3 000 U/g）：上海源聚生物；胰蛋白酶（酶活 250 U/g）、亚油酸（CP级）、吐温-20（CP级）、其他试剂（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物鸡肉中蛋白质样品制备

将鸡肉和猪肉分别绞碎，冷冻干燥后，研磨成粉末，用乙醚脱脂6 h～8 h，即为鸡肉和猪肉蛋白粉，分别装入聚乙烯自封袋内，冷藏备用。

1.3.2 组分含量测

蛋白质含量采用凯氏定氮法分析测定。

非蛋白氮（Nonprotein nitrogen，NPN）是指包括游离氨基酸、多肽在内的蛋白质水解产物，本试验中采用凯氏定氮法测定消化液中非蛋白氮含量[14]。

1.3.3 蛋白质的体外模拟消化

称取2.0 g肌肉蛋白粉悬浮于200 mL pH 1.5的HCl溶液中（底物浓度1%），于37℃～40℃水浴中预热搅拌（转速180 r/min）处理5 min。然后加入胃蛋白酶（酶/底物=1∶20，质量比），开始体外消化。分别在不同消化时间（0、1、5、10、20、30 、60、120 min）从中吸取10 mL消化液，经沸水灭酶（15 min），加入适量20%三氯乙酸沉淀蛋白质后，离心（4 000 r/min，5 min），取上清液定容至50 mL，测定消化液中蛋白质水解度和非蛋白氮含量[10-11]。

胃液消化2 h后，将消化液用1 mol/L NaOH调节至pH8.0～8.5以终止胃蛋白酶活性。加入胰蛋白酶（酶/底物=1∶20，质量比），开始进行胰蛋白酶消化。采用相同的方法测定其中的蛋白质水解度和非蛋白氮含量。

1.3.4 酶解动力学分析

分别称取一定量鸡肉、猪肉蛋白粉，加入200 mL pH1.5HCl溶液，配制底物浓度分别为1%、2%、5%、7%、8%的蛋白液，于37℃～40℃水浴预热（转速180 r/min）处理5 min。然后按照上述体外消化试验，分别完成不同底物浓度下的胃液和肠液消化，消化时间均为2 h。消化结束后，分别吸取消化液20 mL于离心管中在沸水浴中灭酶15 min，用茚三酮比色法测定消化液中游离氨基酸含量[11]。

以单位时间内消化液中游离氨基酸含量增加质量表示蛋白质水解速度（mg/min），计算不同底物浓度（[S]）下对应的水解速度（V），求导后计算米氏常数：

式中：Vmax为该酶促反应的最大速度，mg/min；[S]为底物浓度，mg/mL；Km为米氏常数；V为在某一底物浓度时相应的反应速度，mg/min。

利用Lineweaver-Burk方法作图，即以1/V-1/[S]作图，得到回归方程[16]。所得回归方程纵轴截距为该条件下的 1/Vmax，斜率为 Km/Vmax。

1.3.5 蛋白消化产物制备

将模拟消化2 h后的鸡肉和猪肉蛋白消化液的pH值调至中性，于沸水浴中灭酶15 min，冷冻干燥后即得鸡肉和猪肉在胃液和肠液中的消化产物。冷藏，备用。

1.3.6 产物体外抗氧化性质分析

总还原力采用铁氰化钾比色法，DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基）清除活性采用比色法，参照Liang等[17]的方法测定；脂质过氧化抑制活性用不同浓度的提取物溶液对亚油酸乳状液体系过氧化抑制率表示，按照文献[18]方法分析；亚硝酸盐清除活性采用盐酸萘乙二胺比色法进行测定[19]。

酶解产物体外抗氧化能力LC50值：是指产物抗氧化能力达到50%时所需的浓度（mg/mL）。LC50值越小，其抗氧化活性越强，可由产物抗氧化活性与其浓度间的回归方程计算。

1.4 数据处理方法

采用Excel软件对试验数据进行分析整理并作图，所有样品重复测定3次，以平均值表示最终结果。采用SPSS软件对数据差异显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 鸡肉和猪肉蛋白消化过程的体外模拟

鸡肉和猪肉蛋白体外消化过程中水解度（Degree of Hydrolysis，DH）的变化见图 1。

图1 鸡肉和猪肉蛋白体外消化过程中DH的变化Fig.1 The DH changes of the chicken and pork proteins during digestion in vitro

图1的结果显示，胃液中，两种蛋白质的水解程度随时间延长均呈明显的增加趋势，尤其是在前60分钟内，水解度增加很快，此后，随着时间延长，增速减缓。鸡肉蛋白的水解速度和最终水解度都显著高于猪肉蛋白（p≤0.05），说明鸡肉蛋白比猪肉蛋白更易于消化。在肠液中，前120分钟内，水解度变化趋势与胃液中的相似，鸡肉蛋白水解度显著高于猪肉蛋白（p≤0.05），在随后的60 min内，鸡肉蛋白水解度几乎不再增加，而猪肉蛋白的水解度却继续增加，并逐渐接近鸡肉蛋白在180 min时的水解度。

两种蛋白质在胃液中消化180 min后的水解度在2%左右，在肠液中的水解度增加迅速，180 min后可达13%左右。说明蛋白质消化主要在肠液中，而非胃液中，尤其是小分子量肽类在肠液中的大量生成，也有利于其被小肠内壁的粘膜细胞快速吸收。

消化期间非蛋白氮（NPN）的生成量如图2所示。

图2 鸡肉和猪肉蛋白体外消化过程中NPN的变化Fig.2 The NPN changes of the chicken and pork proteins during digestion in vitro

结果显示，消化液中NPN含量变化趋势与DH变化相似，随消化时间的延长，NPN含量逐渐增加，且无论在胃液中还是在肠液中，鸡肉蛋白的NPN含量始终高于猪肉蛋白。但是与DH变化不同的是，两种蛋白消化液中，NPN在胃液消化前期的增加速度很快，大约消化90 min后，增加速度趋于平缓，似乎接近其最大值。而在肠液中，NPN的变化趋势与胃液中的似乎相反：消化前期速度增加平缓，大约消化后60 min后开始快速增加。在胃液中消化前期，鸡肉和猪肉蛋白消化液中NPN含量差异不显著（p≤0.05），但随消化时间的延长，两者NPN含量存在极显著差异（p≤0.01）。在胰液消化中，两者至始至终在消化液中NPN含量差异性不显著（p≤0.05）。

2.2 鸡肉和猪肉蛋白酶解动力学分析

鸡肉和猪肉蛋白酶解动力学分析见图3、表1。

鸡肉蛋白和猪肉蛋白的酶解动力学曲线（见图3）符合一般酶解反应动力学曲线（米氏方程）特征，即：在底物浓度较低时，呈一级反应；继续增加底物浓度时，反应速度呈曲线增加（混合级反应）；在高底物浓度时，反应速度增加缓慢，甚至不再增加（零级反应）。此外，鸡肉和猪肉蛋白酶解过程中，无论是在胃液中，还是在肠液中，鸡肉蛋白酶解速度均略高于猪肉。在消化前期，两者间的反应速度差异显著（p≤0.05），但随消化时间的延长，反应速度间的差异逐渐减小。

图3 鸡肉和猪肉蛋白的消化动力学曲线Fig.3 The digestive kinetic curves in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins

表1 鸡肉和猪肉蛋白消化动力学参数Table 1 The digestive kinetic curves in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins

采用Lineweaver-Burk作图法，计算得到其米氏方程动力学参数Vmax和Km（表1）。结果显示，在胃液和肠液中，鸡肉蛋白的Vmax均略高于猪肉蛋白，且两者间差异不显著（p≤0.05），说明鸡肉蛋白相比较容易消化。消化期间，猪肉蛋白在胃液、肠液中的Km值（1.315 6、0.075 7）均显著高于鸡肉蛋白（1.003 7、0.057 4）（p≤0.01）。说明在模拟的胃液和肠液消化体系中，鸡肉蛋白与消化酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）分子间的亲和力显著高于猪肉蛋白。该结果与Vmax的结果基本一致。

2.3 蛋白质消化产物抗氧化性

鸡肉和猪肉蛋白消化产物体外抗氧化活性见表2。

表2 鸡肉和猪肉蛋白消化产物体外抗氧化活性Table 2 The antioxidant activities in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins digestive products

结果显示，鸡肉和猪肉蛋白在胃液和肠液中分别经过2 h消化，所得产物的总还原力均随其浓度的增加而增加，存在明显的剂量效应。然而，同一蛋白在胃液和肠液中的消化产物、不同来源膳食蛋白在相同条件下所得消化产物的总还原力间均存在显著差异（p≤0.01）。首先，肠液消化产物的还原力均显著高于其胃液消化产物，其LC50较低；其次，相同条件下，鸡肉蛋白消化产物具有较低的LC50，说明其还原力高于猪肉蛋白消化产物。虽然与相同浓度下VC的还原力相比，鸡肉和猪肉蛋白消化产物的还原力很低，但从营养学角度分析，两种膳食蛋白经胃液和肠液消化后，其总还原力均得到2倍～4倍的增加。

就NO2-清除活性而言，5 mg/mL～10 mg/mL的鸡肉和猪肉肠消化产物具有中等程度的NO2-清除活性，接近与0.067 mg/mL VC溶液的NO2-清除活性。同样，鸡肉和猪肉蛋白消化产物对DPPH·的清除活性差异显著（p≤0.01），这一差异在相同蛋白不同消化阶段产物间也同样存在。与前述实验结果相似，不同蛋白肠液消化产物的DPPH·、NO2-清除活性均显著高于其胃液消化产物。

表2结果显示，两种蛋白肠消化产物抗氧化性显著高于其胃消化产物，且蛋白质间存在显著差异（p≤0.01）。鸡肉蛋白在不同阶段（胃液、肠液）消化产物的体外抗氧化性均显著高于猪肉蛋白（p≤0.01）。说明蛋白质分子经酶解消化后，所得产物具有更强的抗氧化性，可能缘于产物中更多还原性侧链基团的外露，也可能与具有更强抗氧化活性的产物，如抗氧化肽的产生有关。其次，鸡肉消化产物具有更强的抗氧化活性。

鸡肉和猪肉蛋白消化产物脂质过氧化抑制率结果见表3。

在亚油酸过氧化抑制试验中，两种蛋白的4种消化产物均显示出较强的亚油酸过氧化抑制活性。在1mg/mL浓度下即显示出50%～60%以上的抑制率。与前述试验结果相似，肠液消化产物仍显示出较高的过氧化抑制率，但不同蛋白质消化产物间无显著差异（p＞0.05）。

表3 鸡肉和猪肉蛋白消化产物脂质过氧化抑制率Table 3 The peioxidation inhibitory activities in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins digestive products %

3 结论

体内消化动力学性质的模拟研究结果显示，鸡肉蛋白比猪肉蛋白在胃液和肠液中更容易被蛋白酶所水解，生成更多的游离氨基酸和非蛋白氮（NPN），鸡肉蛋白具有更低的Km值，表明鸡肉蛋白比猪肉蛋白与蛋白酶具有更高的亲和力。体外抗氧化活性分析结果显示，经胃液、肠液消化后，两种肌肉蛋白消化产物的抗氧化活性显著增强（p≤0.01），且差异显著（p≤0.01），除体外油脂过氧化抑制活性外，鸡肉蛋白消化产物显示出比猪肉蛋白消化产物更强的体外抗氧化活性。两种蛋白消化产物均显示出较强的脂质过氧化抑制活性，且无显著差异（p＞0.05）。

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The Enzymatic Hydrolysis Kinetics and Products Properties of Chicken and Pork Protein

ZHANG Cuan1，CHEN Zhi-hong1，CHEN Jing1，YUAN Huai-bo2
（1.School of Biological Science and Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，Anhui，China；2.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

Using in vitro modeling methods，the enzymatic hydrolysis kinetics of chicken and pork proteins and the antioxidant activities of their enzymatic hydrolysis products in gastric and intestinal were investigated.The results showed that chicken protein could be easier hydrolyzed than pork protein，and more amino acids and non-protein nitrogen（NPN）could be found in hydrolysis products.The analysis results of hydrolysis kinetics showed chicken protein had lower Kmand higher Vmaxvalues than pork protein.The in vitro analysis result showed the antioxidant activities were significantly enhanced after digestion in gastric and intestinal juices（p≤0.01），besides their lipid inhibitive capacities.And there were remarkable differences between two proteins（p≤0.01）.Above results indicated there were different hydrolysis kinetics characteristics and their products showed different antioxidant activities between chicken and pork proteins.

chicken protein；pork protein；enzymatic hydrolysis kinetics；hydrolysis products；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.004

安徽省教育厅高校自然科学研究重大项目（2013ZD006）；滁州学院食品酶法加工科技创新团队项目（00001702）

张汆（1970—），女（汉），教授，博士，主要从事食品化学与营养学、膳食蛋白方向的研究。

2017-05-14