响应面法优化牛蒡中绿原酸提取分离条件

张嫚，李爽，万国福，张兰

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003；2.青岛捷安信检验技术服务有限公司，山东青岛266071）

响应面法优化牛蒡中绿原酸提取分离条件

张嫚1，李爽2，万国福1，张兰1

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003；2.青岛捷安信检验技术服务有限公司，山东青岛266071）

以黄牛蒡等外根为原料，通过单因素试验确定以甲醇为提取剂，甲醇浓度、液料比和超声处理时间为显著因素。以上述3个因素为自变量设计了Central Composite Design（CCD）试验，试验结果表明其最佳水平分别为提取剂甲醇浓度50%、牛蒡甲醇料液比1∶100（g/mL）、超声提取的时间30min，在此条件下，牛蒡绿原酸的提取量达3.244mg/g。

牛蒡；绿原酸；超声提取；响应面

近年来，牛蒡在江苏、山东大量种植推广[1]。年出口牛蒡在7万吨以上。但产品多以盐牛蒡、冷冻什锦蔬菜、速冻牛蒡3种形式出口[2]。目前，中国药典中将牛蒡列为药食同源植物[3]，但国内牛蒡消费量较少，且形态单一，主要作为蔬菜、茶和中药出售，商品化程度、附加值和消费量都很低。大量的牛蒡等外根价格低廉，难以售出，不仅降低农民的收入，也造成极大的浪费[4]。从牛蒡中提取绿原酸、多糖、菊糖、糖蛋白等生理活性成分是牛蒡产品精深加工和产业增值的重要方向[5-8]。本文对牛蒡的等外根中的绿原酸提取条件进行了优化，并采用高效液相色谱法进行了绿原酸含量的检测，以期为牛蒡绿原酸的工业化提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

两年生新鲜牛蒡等外根：江苏徐州丰县。

1.2 试剂

绿原酸标品（含量98%）：北京盛世康普化工技术研究院；其他试剂均为分析纯，色谱纯，水为蒸馏水。

1.3 仪器

Aglient1200高效液相色谱：安捷伦科技有限公司；AL204电子天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；GY92-IIN型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KH-100B型超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司。

1.4 牛蒡预处理工艺流程

新鲜的黄牛蒡等外根洗净，100℃下灭酶2 min，冷却，采用0.5%柠檬酸+0.7%VC+1%NaCl护色，去皮、切片、烘干、粉碎、过60目筛，得牛蒡根干粉，备用[9]。

1.5 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）为流动相；检测波长为327 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000[10-12]。

1.6 测定溶液制备

1.6.1 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

1.6.2 绿原酸的提取

精密称取牛蒡粉1.000 g，置具塞锥形瓶中，精密加入一定体积的提取溶剂，称重，在特定条件下超声处理一定时间，冷却，再次称重，并用提取溶剂补足减失重量，摇匀，过滤，精密量取过滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，HPLC测定其含量，计算提取量[13-15]。

1.6.3 测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.6.4 绿原酸标样和牛蒡样品HPLC图谱

按上述条件测得绿原酸标样和牛蒡样品HPLC图谱见图1。

图1 绿原酸标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of chlorogenic acid sdandard

图2 牛蒡样品HPLC图谱Fig.2 Sample chromatogram of Arctium lappa L．

2 试验设计

2.1 单因素试验

分别以不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮为提取剂，以确定的最佳提取剂为进一步研究对象，确定液料比、提取温度、超声处理时间对牛蒡绿原酸提取率的影响。

2.2 Central Composite Design（CCD）设计

通过单因素试验筛选得到3个显著因素，以提取剂的浓度、液料比和超声处理的时间3个因素为自变量，每个因素编码水平见表1，根据相应的试验表进行试验后，使用Design-Expert 8.0 Trial软件进行响应面分析[16-18]。

表1 CCD试验因素水平及其编码Table 1 The factors and levels of Central Composite Design

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 提取剂对绿原酸提取量的影响

甲醇、乙醇、丙酮为提取剂，料液比为 1∶100（g/mL），在室温下超声处理30 min，测得样品中绿原酸的提取量[19]，结果如图3所示。

图3 提取剂浓度对绿原酸提取量的影响Fig.3 Effect of extracting agent concentration on extraction yield of chlorogenic acid

相同处理条件，以水为提取剂时绿原酸的提取量为0.95 mg/g，由图3可见3种提取剂均可显著增加牛蒡中绿原酸的提取量，并随着提取剂浓度的增加，提取量随之增加，其中甲醇提取效果最佳，并且浓度达到50%时，提取量达到峰值2.89 mg/g。

3.1.2 料液比对绿原酸提取量的影响

牛蒡/甲醇料液比对绿原酸提取量的影响结果见图4所示。

图4 牛蒡/甲醇料液比对绿原酸提取量的影响Fig.4 Effect of Arctium lappa L./methanol ratio on extraction yield of chlorogenic acid

以50%甲醇为提取剂，牛蒡中绿原酸的提取量随提取剂的增加而逐渐提高，当料液比达到1∶100（g/mL）时，提取量达到最高，并保持平稳状态。

3.1.3 提取温度对绿原酸提取量的影响

以50%甲醇为提取液，以1∶100（g/mL）的料液比，考察提取温度对绿原酸提取量的影响，结果如图5所示。

图5 提取温度对绿原酸提取量的影响Fig.5 Effect of extracting temperature on extraction yield of chlorogenic acid

试验表明过低的温度（低于20℃）会显著影响绿原酸的提取量，提取量随着温度的增加而增大，当温度达到30℃以上时，则趋于稳定。

3.1.4 超声处理时间对绿原酸提取量的影响

超声处理可加速溶剂穿透组织的作用，缩短浸提的时间[20]，超声处理时间对绿原酸提取量的影响见图6所示。

图6 超声处理时间对绿原酸提取量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

试验表明，随着超声时间的延长，绿原酸的提取量随之增加，当超声时间达到30 min时即可获得理想的效果，提取量达到2.89 mg/g，30 min后，超声时间的延长并不能增加绿原酸提取量。

3.2 响应面试验结果与分析

CCD试验设计表及其结果如表2所示，方差分析见表3。

表2 CCD试验设计表及其结果Table 2 The CCD experiment design and response values

表3 牛蒡中绿原酸提取量的方差分析结果Table 3 ANOVA for the yield of chlorogenic acid with various extraction conditions

试验数据使用Design-Expert8.0Trial软件进行二次回归拟合后，得到如下回归方程：

方差分析显著性检验表明，R2=91.31%，方程回归性显著。预测模型的使用条件牛蒡甲醇料液比为1∶80（g/mL）～1 ∶120（g/mL），提取剂甲醇浓度为 40%～60%、超声提取的时间为20 min～40 min，在此条件下可以用该模型预测牛蒡中绿原酸的提取量。

利用Design-Expert8.0Trial软件对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析图（图7～图9）对回归方程求解，得到模型极值点，即牛蒡甲醇料液比为1∶100（g/mL）、提取剂甲醇浓度为50%、超声提取的时间为30 min，此条件下可以牛蒡绿原酸的提取量达3.244 mg/g。

图7 甲醇浓度和液料比对绿原酸提取量交互作用的相应面Fig.7 Response surface showing the effects of methanol concentration and material/water ratio on extraction yield of chlorogenic acid

图8 甲醇浓度和超声处理时间对绿原酸提取量交互作用的相应面Fig.8 Response surface showing the effects of methanol concentration and ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

图9 液料比和超声处理时间对绿原酸提取量交互作用的相应面Fig.9 Response surface showing the effects of material/water ratio and ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

3.3 优化结果验证

为检验模型的准确性，在预测最佳提取条件下平行试验3次，牛蒡中绿原酸实际提取量为3.173 mg/g，与预测值3.244 mg/g接近，证明该模型能较好的预测绿原酸的实际提取量。

3.4 结论

通过单因素试验筛选得到3个显著因素，提取剂的浓度、液料比和超声处理的时间。以上述3个因素为自变量设计了CCD试验，试验结果表明其最佳水平分别为牛蒡甲醇料液比为1∶100（g/mL）、提取剂甲醇浓度为50%、超声提取的时间为30 min，此条件下可以牛蒡绿原酸的提取量达3.244 mg/g。在最佳提取条件下，非重要因子及其水平分别为：超声波温度为30℃。

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Optimization of Extraction Process for Chlorogenic Acid from Actium lappa L.by Response Surface Analysis

ZHANG Man1，LI Shuang2，WAN Guo-fu1，ZHANG Lan1
（1.Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huai′an 223003，Jiangsu，China；2.Qingdao J&C Testing Technology Services Co.，Ltd.，Qingdao 266071，Shandong，China）

The paper studied the extraction amount of chlorogenic acid from off-grade Arctium lappa L．by a single factor test the factors such as methanol extraction agent，concentration of extractant，liquid/material ratio and ultrasonic treatment time were determined.The Central Composite Design and result analysis proved that the optimal extraction condition for three important factors were methanol concentration 50%，solid to liquid ratio 1 ∶100（g/mL），extracting time 30 min respectively.Under this condition the extraction amount of chlorogenic acid from Arctium lappa L．was 3.244 mg/g.

Arctium lappa L．；chlorogenic acid；ultrasonic wave extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.007

江苏省淮安市农业科技支撑计划（SN13087）

张嫚（1975—），女（汉），副教授，硕士，从事食品安全与质量控制研究。

2017-05-04