广西壮族自治区壮族人群MACROD2基因rs2208454位点单核苷酸多态性与缺血性脑卒中发病的关系

江东东，罗曼

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021 )

广西壮族自治区壮族人群MACROD2基因rs2208454位点单核苷酸多态性与缺血性脑卒中发病的关系

江东东，罗曼

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021 )

目的探讨广西壮族自治区壮族人群MACROD2基因rs2208454位点单核苷酸多态性(SNP)与缺血性脑卒中(IS)发病的关系。方法采用SNaPshot法对101例广西壮族IS患者(IS组)及104例健康体检者(对照组)的MACROD2基因rs2208454位点单核苷酸进行检测分析。结果两组MACROD2基因rs2208454位点GG、GT、TT基因型及G、T等位基因分布相比，P均gt;0.05；在显性(TT+GT和GG)、隐性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三种遗传模型下，MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS患病风险无关联(P均gt;0.05)。结论广西壮族人群MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS发病可能不相关。

MACROD2基因；MACROD2基因rs2208454位点；单核苷酸多态性；脑卒中；缺血性脑卒中

脑卒中是临床常见的脑血管疾病之一，尽管其发病率和死亡率随着医疗保健水平的提高已有所下降，但随着全球人口老龄化加剧，该病患者的绝对数仍呈逐年上升趋势，不仅严重影响患者的生活质量，也给社会带来沉重的经济负担[1, 2]。缺血性脑卒中(IS)作为脑卒中最为常见的类型，尽管其发病机制尚未完全阐明，但研究[3, 4]显示遗传易感基因在IS的病因学及发病机制中扮演重要角色。全基因组关联研究(GWAS)的出现，为候选易感基因的选择提供了重要依据，也使得从全基因组范围的视角筛查与疾病相关联的易感基因成为近年的研究热点之一。2010年的一项GWAS[5]表明，MACROD2基因单核苷酸多态性(SNP)与静默型脑梗死的发病显著相关，其中 rs2208454位点的SNP与静默型脑梗死的发病关系最密切。本研究对101例广西壮族人群IS患者及104例健康体检者的MACROD2基因rs2208454位点的SNP进行了观察，旨在探讨广西壮族人群MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年1月～2015年12月就诊于崇左市人民医院及扶绥县人民医院神经内科的IS患者101例(IS组)，男69例，女32例；年龄33～95岁；均符合第四届全国脑血管病学术会议修订的IS诊断标准，并经颅脑CT或磁共振成像、DSA检查确诊；排除短暂性脑缺血发作和脑动静脉畸形，以及蛛网膜下腔出血、木僵、严重感染、恶性肿瘤、严重肝肾功能异常患者。同期收集104例健康体检者(对照组)作对照，男70例，女34例；年龄34～91岁；排除脑血管疾病、严重感染、恶性肿瘤、严重肝肾功能异常、内分泌疾病患者。两组性别、年龄相匹配，具有可比性。受试者均为广西壮族自治区崇左地区无亲缘关系的常住壮族居民，至少三代直系亲属内无其他民族，受试者均知情同意。两组BMI、血压、血脂水平比较见表1。

表1 两组BMI、血压、吸烟史、血脂水平比较

注：与对照组相比，*Plt;0.01。

1.2 MACROD2基因rs2208454位点单核苷酸检测及基因分型 ①DNA提取及扩增：于早晨空腹抽取受试者外周静脉血2 mL，EDTA抗凝。使用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司提供)提取全血细胞基因组DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。PCR扩增引物设计使用Primer3软件，上游引物序列为5′-GCCACACCTTTGTACCGTGTGT-3′，下游引物序列为5′-TCTCCAAAATAAACCAGCAACCAAAA-3′，引物由上海生物工程公司合成。PCR反应体系：1×GC缓冲液I，0.3 mmoL/L的dNTP，3.0 mmoL/L的氯化镁，1μL样本基因组DNA，1 μL的PCR引物，1 U的 Taq DNA聚合酶，反应总体积20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；此后11个循环，每个循环94 ℃变性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min；继续24个循环，每个循环94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min；最后以72 ℃延伸2 min。PCR产物4 ℃保存备用。②单核苷酸检测及基因分型：取PCR产物20 μL，加入5 U虾碱酶、2 U外切酶， 37 ℃温浴1 h，75 ℃灭活15 min。此后进行SNaPshot多重单碱基延伸反应。延伸引物序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAAC-CATCTAGTTAGGCCAA，引物由上海生物工程公司合成。延伸反应体系：纯化后PCR产物2 μL，SNaPshot反应试剂5 μL，延伸引物1 μL，超纯水2 μL，反应总体积10 μL。反应条件：96 ℃预变性1 min；随后28个循环，每个循环96 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s；延伸产物4 ℃保存备用。为纯化延伸产物，于10 μL延伸产物中加入虾碱酶1 U，37 ℃温浴1 h，75 ℃灭活15 min。取0.5 μL纯化后的延伸产物，95 ℃变性处理后在ABI3730XL测序仪上样，用GeneMapper 4.1分析检出GG、GT、TT三种基因型。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料比较及Hardy-Weinberg平衡用χ2检验；用单因素非条件Logistic回归分析法分析MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS的关联，用多因素非条件Logistic回归分析法对混杂因素进行校正，计算比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)。所有检验为双侧，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组及IS组各基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(对照组：χ2=0.395，P=0.530；IS组：χ2=0.052，P=0.820)，均有群体代表性；两组MACROD2基因rs2208454位点GG、GT、TT基因型及G、T等位基因分布相比，P均gt;0.05，结果详见表2。

表2 两组SNP rs2208454位点基因型及等位基因分布

多因素非条件Logistic回归分析显示，在显性(TT+GT和GG)、隐性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三种遗传模型下，MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS患病风险无关联[OR分别为0.989(95%CI为0.568～1.721)、0.877(95%CI为0.394～1.949)、0.887(95%CI为0.378～2.082)，P均gt;0.05]。为调整多重因素对IS的影响，以IS为因变量，将收缩压、舒张压、TG及HDL-C作为混杂因素进行校正后，进一步行多因素非条件Logistic回归分析显示，在显性(TT+GT和 GG)、隐性(TT和GT+GG)及加性(TT和GG)三种遗传模型下，MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS患病风险也无关联[OR分别为1.210(95%CI为0.555～2.637)、0.726(95%CI为0.241～2.187)、0.734(95%CI为0.223-2.415)，P均gt;0.05]。

3 讨论

MACROD2基因定位于人类20号染色体上的20p12区域，rs2208454位点嵌于该基因第3内含子上。由MACROD2基因编码的相应蛋白质的功能目前仍未完全阐明。有研究[5]显示，MACROD2基因包含一段在胎儿及成人脑组织中均有表达的宏观结构域，该结构域与腺苷二磷酸(ADP)-核糖相联结，推测其可能在ADP-核糖基化过程中发挥了重要作用。ADP-核糖基化是一种将ADP-核糖基团连接到相关受体蛋白上的翻译后修饰过程，其广泛存在于DNA损伤修复、转录激活与抑制、端粒及核染色质生物调控等过程中，是生物体遗传信息传递、表达和蛋白质结构、功能转换的主要调控手段之一。既往研究[6～9]显示，MACROD2基因SNP与自闭症、痴呆及高血压等多种疾病的发病有关。也有研究[5]认为，MACROD2基因rs2208454位点T等位基因携带可降低静默型脑梗死的发病风险。另一项研究[10]表明，MACROD2基因rs2208454位点TT型基因携带者IS的患病风险显著升高。新近一项研究[11]指出，MACROD2基因rs2208454位点SNP与脑出血不相关。本研究结果显示，广西壮族人群IS组与对照组MACROD2基因rs2208454位点GG、GT、TT三种基因型及G、T等位基因分布差异无统计学意义，其MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS发病也无关。

本研究发现，广西壮族人群MACROD2基因的T等位基因频率为36%，有研究[5, 10]显示广东汉族人群T等位基因频率为25%，欧美人群T等位基因频率为20%，提示MACROD2基因点突变的发生在不同地域及不同民族、种族的人群中存在显著差异。有关MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS的关系，目前研究结果不同，可能与民族、种族、地域不同及饮食、环境、生活习惯不同等有一定关系。同时，不同的IS亚型，其发病机制、病理特征及影响因素存在较大差异，样本采集方式、病例纳入和排除标准的选择及不同的病例分组对研究结果也有一定影响。

综上所述，本研究结果显示广西壮族人群MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS发病风险无关。IS作为一种多基因遗传、多因素参与的复杂性疾病，不同民族、种族、地域人群间的遗传异质性广泛存在，不同环境因素间存在交互作用，不同IS亚型的发病机制间存在差异，可能单一基因特定位点的突变不足以导致IS事件的发生。鉴于本研究样本量的限制及样本民族、种族、地域等客观因素的局限性，我们认为在MACROD2基因rs2208454位点SNP与IS的相关性研究中，仍需进一步扩大样本量，对多民族、多地域、多种族进行综合比较研究，对多组候选基因进行多位点关联分析，对IS的不同亚型进一步比较分析，统一病例入选和排除标准，对入选对象的饮食、环境、生活习惯等因素进行严格匹配，以进一步验证相关研究结果。

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Relationshipbetweenrs2208454singlenucleotidepolymorphismofMACROD2geneandischemicstrokeinZhuangpopulationofGuangxiZhuangautonomousregion

JIANGDongdong,LUOMan

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) of rs2208454 in MACROD2 gene and ischemic stroke (IS) in Zhuang population of Guangxi Zhuang autonomous region.MethodsThe rs2208454 single nucleotide of MACROD2 gene was detected by SNaPshot technique in 101 cases of Guangxi Zhuang IS patients (IS group) and 104 healthy subjects (control group).ResultsThe GG, GT, TT genotypes and G, T allele distribution of rs2208454 locus of MACROD2 gene were not statistically different between these two groups (allPgt;0.05). The rs2208454 locus SNP of MACROD2 gene was not associated with the risk of IS in dominant (TT+GT and GG), recessive (TT and GT+GG) and additive (TT and GG) genetic models (allPgt;0.05).ConclusionThe rs2208454 locus SNP of MACROD2 gene has no correlation with the pathogenesis of IS in Guangxi Zhuang population.

MACROD2 gene; MACROD2 gene rs2208454; single nucleotide polymorphism; stroke; ischemic stroke

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.004

R743

A

1002-266X(2017)43-0011-03

广西壮族自治区自然科学基金资助项目(2013GXNSFBA019131， 2015GXNSFAA139171)。

江东东(1987-)，男，在读硕士研究生，主治医师，主要研究方向为脑血管病的诊治。E-mail: jiangdodong@126.com

罗曼(1980-)，女，博士，副主任医师，主要研究方向为脑血管病。E-mail: manro130@126.com

2017-07-07)