高脂饮食对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响研究

胡波 李德才

621000四川绵阳四○四医院心内科

高脂饮食对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响研究

胡波 李德才

621000四川绵阳四○四医院心内科

目的：探讨高脂饮食对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响。方法：将SD大鼠分为对照组(N组)、糖尿病组(D组)和高脂饮食组(H组)。H组以高脂饲料喂养，其余两组以普通饲料喂养。结果：D组大鼠心肌TNF-α表达较对照组明显升高，H组心肌TNF-α表达明显较N组及D组升高(P＜0.05)。D组及H组心肌EGFR、TGF-β1表达均增加(P＜0.05)。结论：高脂饮食通过上调TNF-α、EGFR、TGF-β1表达及增加心肌胶原纤维沉积，在糖尿病心肌纤维化过程中具有重要作用。

糖尿病；心肌纤维化；高脂饮食

糖尿病(DM)具有病程长、并发症多等特点，其中糖尿病心肌病(DC)是其严重的并发症之一，是引起糖尿病患者心力衰竭的重要原因。DC的发生与冠状动脉粥样硬化无关，其发病原因目前尚未完全明确。DC早期临床表现为心脏舒张功能障碍，逐渐进展为心肌收缩功能障碍，病理学检查可发现心肌细胞肥大、坏死，心肌间质纤维化，胶原大量沉积[1]。糖脂代谢异常是DM的显著特征，高脂血症是否与DC的发生、发展有关尚未明确。本研究采用糖尿病大鼠模型，给予高脂饮食，观察糖尿病大鼠心肌胶原、TNF-α及表皮生长因子受体(EGFR)、转化生长因子β1(TGF-β1)的表达，了解高脂血症在DC发病中的作用。

资料与方法

建立糖尿病大鼠模型并分组：8周龄雄性SD大鼠60只，体重180～200 g，随机分为正常对照组(N组20只)和造模组(40只)。禁食12 h后，对照组注射65mg/kg缓冲液；造模组按照同体积一次性腹腔注射链脲佐菌素，72 h后，采鼠尾静脉血测血糖，以随机血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型成立。共38只符合糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病组(D组，18只)和高脂饮食组(H组，20只)。N组和D组喂以普通饲料，H组以高脂饲料喂养12周。

方法：①标本收集：实验结束时禁食10 h，称取每只大鼠体重(BW)。腹主静脉取血测血脂。大鼠断头处死后迅速取出心脏，测量左室质量(LVM)，计算左室质量指数(LVMI)=LVM/BW，用于评价左心室肥厚程度。采用10%中性甲醛固定部分左心室组织，供天狼猩红和免疫组化染色；另取部分组织做心肌EGFR、TGF-β1的检测。②测定血糖和血脂生化指标。③心肌胶原及TNF-α表达检测：取心室部冠状切面心肌组织，常规脱水石蜡包埋，制作切片，连续切片(厚5μm)，标本脱蜡，梯度乙醇脱水。胶原检测采用苦味酸天狼猩红染色，具体步骤按试剂盒说明进行。操作结束后在光镜下观察胶原纤维阳性区染呈红色，细胞核呈蓝色，在偏振光显微镜下采集图像，测定红色和橙黄色的Ⅰ型胶原、绿色的Ⅲ型胶原，得到Ⅰ、Ⅲ型胶原含量，计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。TNF-α表达检测采用免疫组化SP法，按照试剂盒说明进行，细胞质内出现黄色为阳性反应。在光学显微镜400倍下观察：每张切片按顺序选10个视野，分别检测每个视野内阳性细胞数，最后以每组的均值进行数据处理。④EGFR、TGF-β1Western blot：提取心肌组织总蛋白后，样品150μg用10%SDS-PAGE电泳后半干式转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h。EGFR、TGF-β1一抗1:250稀释，室温过夜，加马抗山羊IgG抗体(1:500稀释)室温反应1.5 h，DAB显色，膜置滤纸上干燥，扫描，以β-actin为对照，进行半定量分析。

统计学方法：采用SPSS 10.5进行统计分析，计量资料以±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，用q检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组大鼠LVMI、生化指标的改变：D组大鼠LVMI、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯均较N组明显增加(P＜0.05)，H组大鼠LVMI、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯均较D组及N组升高，组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

光镜观察结果：N组大鼠心肌组织结构完整，心肌细胞排列整齐、致密，结构清晰。D组及H组大鼠心肌组织结构发生明显改变，表现为心肌细胞排列紊乱、细胞肥大、细胞间隙扩大。N组大鼠心肌间血管周围可见少许胶原纤维沉积，D组及H组大鼠血管周围胶原纤维沉积明显增加。

各组大鼠心肌胶原、TNF-α的表达：各组心肌组织均有胶原表达。与N组相比较，D组和H组大鼠心肌间质胶原纤维明显增多(P＜0.05)；与D组相比较，H组大鼠心肌间质胶原纤维明显增加(P＜0.05)。TNF-α在N组心肌细胞质内弱表达，而其在D组心肌细胞质中表达明显增加，H组中表达较D组明显增加，组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

各组大鼠EGFR、TGF-β1的表达：糖尿病大鼠心肌组织均有一定程度EGFR、TGF-β1表达。与N组比较，D组及H组EGFR、TGF-β1表达增加，组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。H组EGFR、TGF-β1表达较D组增加，MMP-9/TIMP-1比值降低，组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3和图1。

讨 论

研究表明，＞70%的糖尿病患者因并发心血管系统疾病而死亡，是非糖尿病患者的2～3倍。DC主要表现为心肌细胞肥大、凋亡、间质纤维化及血管壁增厚，其发病不依赖于高血压、冠状动脉疾病和其他已知心脏疾病。研究认为心肌间质纤维化可能是DC的特征性病理改变[2]，心肌纤维化是心肌重构的主要特征，表现为细胞外基质合成与降解失衡，心肌组织结构中collagenⅠ和collagenⅢ含量明显增加[3]。本实验通过腹腔注射STZ建模糖尿病大鼠成功，心肌组织染色可见心肌组织结构紊乱、纤维增生明显，与文献报道相符[4]。予以高脂饮食饲养后心肌纤维组织明显增生，表明高脂饮食可促进糖尿病大鼠心肌纤维化。

表1 各组LVMI、生化指标比较(±s)

表1 各组LVMI、生化指标比较(±s)

注：与对照组比较，①P＜0.05；与D组间比较，②P＜0.05。

·组别 只数 LVM I(mg/g) FPG(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L)N组 20 1.82±0.22 4.36±0.32 0.80±0.14 0.58±0.18 D组 18 2.46±0.32① 17.22±3.42① 3.46±1.84① 3.85±0.71①H组 20 3.15±0.41①②·19.61±3.82①②·4.25±1.56①②5.05±1.19①②·

表2 各组心肌胶原、TNF-α表达比较±s)

表2 各组心肌胶原、TNF-α表达比较±s)

注：与对照组比较，①P＜0.05；与D组间比较，②P＜0.05。

组别 只数 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 Ⅰ/Ⅲ胶原比值 TNF-a N组 20 2.56±0.05 1.58±0.04 1.62±0.04 0.21±0.02 D组 18 3.35±0.08① 1.82±0.05① 1.85±0.06① 0.45±0.03①H组 20 4.56±0.12①② 2.02±0.09①② 2.32±0.10①② 0.84±0.06①②

表3 各组EGFR、TGF-β1表达的比较±s)

表3 各组EGFR、TGF-β1表达的比较±s)

注：与对照组比较，①P＜0.05；与D组间比较，②P＜0.05。

组别 只数 EGFR TGF-β1 N组 20 1.54±0.42 0.82±0.06 D组 18 2.65±0.62① 1.98±0.56①H组 20 4.34±0.84①② 2.75±0.60①②

图1 各组EGFR、TGF-β1蛋白的表达

在糖尿病机体中引起心肌间质纤维化的因素众多，其中TNF-α、EGFR及TGF-β1等细胞因子被认为是促发心肌纤维化的重要的因素。TNF-α作为判断心衰程度和预后的指标[5]。TNF-α可诱导原癌基因c-myc和c-f0smRNA表达，引起心肌间质胶原纤维堆积、胶原蛋白沉着和间质纤维化，导致心肌重构。EGFR对促进细胞增殖具有重要的作用，EGFR可通过激活CTGF调节细胞增殖、凋亡、迁移，促进心肌纤维化[6]。在EGFR基因敲除小鼠血管及心肌组织中纤维化较正常小鼠明显减少，从反面证实了EGFR能促进心肌纤维化[7]。TGF-β1是公认的引起心肌间质纤维化最重要因素之一，也是诸多因素所致心肌纤维化的共同通路[8]。活化型TGF-β1受体介导TGF-β1的作用，使心肌成纤维细胞合成细胞外基质，并抑制蛋白水解酶表达，抑制纤溶酶原、胶原酶基质酶原等酶激活物的产生，导致ECM降解作用减慢，造成ECM的沉积，从而引起心肌纤维化[9]。本研究发现糖尿病大鼠心肌TNF-α、EGFR及TGF-β1表达增加，高脂饮食可进一步诱导其表达，表明高脂饮食可促进糖尿病大鼠心肌纤维化。

本研究通过建立糖尿病大鼠模型，并予以高脂饮食诱发高脂血症，初步发现高脂饮食在糖尿病大鼠心肌间质纤维化发生、发展的病理过程中具有重要作用，表明高脂血症可能参与了DC的发生发展，其进一步作用机制值得继续研究。

[1]Boudina S,Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited[J].Circulation, 2007,115:3213-3223..

[2]Asbun J,Villarreal FJ.The pathogenesis of myocardial fibrosis in the setting of diabetic cardiomyopathy[J].J Am Coil Cardiol,2006,47(4):693-700.

[3]黄娅茜,王宪,孔炜.糖尿病心肌病发病机制的研究进展[J].生理科学进展,2010,41(1):31-36.

[4]Murarka S,MR Movahed.Diabetic cardiomyopathy[J].JCard Fail,2010,16(12):971-979.

[5]DeswalA,Petersen NJ,Feldmen AM,etal.Cytokines and cytokines receptors in advanced heart failure:an analysis of the cytokine database from the Vesnarinone Trial(VEST)[J].Circulation,2001,103(11):2055-2059.

[6]Recchia AG,Filice E,Pelle no D,et al.Endothelin-1 induces connective tissue growth factor expression in cardiomyocytes[J].JMol CellCardiol,2009,46(3):352-359.

[7]Schreier B,Rate S,Schneider B,et al.Loss of epidermal growth factor receptor in vascular smooth muscle cells and eardiomyoeytes causes arterial hypotension and cardiac hypertrophy[J].Hypertension,2013,61(2):333-340.

[8]Laviades C,Varo N,Diez J.Transforming growth factorβin hypertensiveswith cardiorenal damage[J].Hypertension,2000,36(4):517-522.

[9]Kuwahara F,Kai H,Tokuda K,et al.Transforming growth factor-beta function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure—overloaded rats[J].Circulation,2002,106(1):130-135.

Study on the effect of high fat diet on myocardial fibrosis in diabetic rats

Hu Bo,Li Decai
Department of Cardiology,Mianyang No.404 Hospital of Sichuan621000

Objective:To investigate the effect of high-fat diet on myocardial fibrosis in diabetic rats.Methods:SD rats were divided into the control group(group N),the diabetic group(group D)and the high fat diet group(group H).Group H was fed with high fat diet,and the other two groups were fed with normal diet.Results:The expression of TNF-a in the myocardium of the D group was significantly higher than that in the control group,and the expression of TNF-a in the H group was significantly higher than that in the N group and the D group(P＜0.05).The expressions of EGFR and TGF-β1in myocardium of the D group and the H group increased(P＜0.05).Conclusion:High fat diet plays an important role in the process of myocardial fibrosis in diabetes by up regulating the expression of TNF-a,EGFR,TGF-β1,and increasing the deposition of myocardial collagen fibers.

Diabetes;Myocardial fibrosis;High-fat diet

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.33.1

科研项目四川省绵阳市原卫生局科研课题(编号201335)

Research projectscientific research project of Mianyang health bureau of Sichuan province(No.201335)