结直肠癌组织中SLC12A5、MMP-7表达变化及意义

王晓元,李曙光,赵轶峰,杨永江,李坤

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

结直肠癌组织中SLC12A5、MMP-7表达变化及意义

王晓元,李曙光,赵轶峰,杨永江,李坤

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

目的观察溶质载体家族12A5基因(SLC12A5)和基质金属蛋白酶7(MMP-7)在结直肠癌组织中的表达变化，并探讨其意义。方法采用免疫组化SP法检测40例结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中SLC12A5和MMP-7表达，分析二者表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系。SLC12A5和MMP-7相关性分析采用Pearson法。结果SLC12A5在癌旁正常组织和癌组织中阳性表达率分别为32.50%(13/40)和87.50%(35/40)，Plt;0.001；MMP-7在癌旁正常组织和癌组织中阳性表达率分别为27.50%(11/40)和80%(32/40)，Plt;0.001；SLC12A5和MMP-7表达与结直肠癌患者的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、肝转移和脉管浸润有关(P均lt;0.05)；SLC12A5在结直肠癌组织中的表达与MMP-7呈正相关(r=0.479,P=0.000)。结论SLC12A5和MMP-7在结直肠癌组织中呈高表达，二者可能在结直肠癌的侵袭、转移中发挥协同作用。

结直肠肿瘤；溶质载体家族12A5基因；基质金属蛋白酶7

据2012年全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN 2012)统计，在世界范围内结直肠癌发病居恶性肿瘤第3位，死亡居恶性肿瘤第4位。中国结直肠癌新发病例占全球的18.6%，且发病年龄趋于年轻化，结直肠癌居中国人群恶性肿瘤死因顺位第5位。近年来，中国结直肠癌死亡人数大幅增加。溶质载体家族12A5基因(SLC12A5)是一种新型致癌基因，存在于真核细胞中，该基因能显著增强细胞增殖和细胞G1～S期转化，同时增强细胞侵袭和转移能力，抑制肿瘤细胞凋亡[1]。目前仅在膀胱移行细胞癌中发现SLC12A5呈高表达状态，在神经功能疾病中SLC12A5发挥重要作用[2，3]，而在结直肠癌方面的研究鲜有报道。基质金属蛋白酶7(MMP-7)是由内皮细胞、粒细胞、肿瘤细胞等合成和分泌的一种蛋白水解酶，与肿瘤细胞浸润和转移等生物学行为密切相关，且能参与肿瘤细胞淋巴管和血管的生成[4]。2016年9月，我们采用免疫组化SP法检测了40例结直肠癌患者癌及癌旁正常组织中SLC12A5和MMP-7表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年9月～2017年1月河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科手术切除的结直肠癌组织40例份，患者男25例、女15例，年龄32～70(50.5±14.6)岁。肿瘤直径≥5 cm者26例，lt;5 cm者14例；肿瘤分化程度为高分化9例，中分化18例，低分化13例；浆膜浸润34例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期32例；淋巴结转移24例；肝转移9例；脉管浸润11例。另取癌标本残端切缘(距肿瘤组织gt;5 cm)经病理检查证实为癌旁正常肠组织40例份。病例均为原发性肿瘤，且术前未行新辅助放化疗等针对性治疗，术后标本均在1 h内获得，并存于液氮中。

1.2 癌及癌旁组织中SLC12A5和MMP-7蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。10%甲醛溶液固定标本，石蜡包埋，切片4 μm，苏木精-伊红染色。切片经80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液高温高压水化修复；PBS洗3次，加一抗(1∶100)50 μL，4 ℃过夜；PBS洗3次，加二抗50 μL。室温下DAB显色，PBS洗3次，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化，流水冲洗10 min，梯度乙醇脱水，松节油透明，树胶封片，阴性对照为PBS代替一抗，光镜下观察。SLC12A5阳性染色主要集中于细胞质中，少量表达于细胞核，MMP-7阳性染色主要集中于细胞质中，少量表达于细胞膜，均为棕黄色或褐色颗粒，计算阳性细胞百分比并评分，≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，gt;75%为4分；无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分。两者相乘，0分为-,1～4分为+,5～8分为++,9～12分为+++，+～+++均视为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验。分析SLC12A5和MMP-7表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系，SLC12A5和MMP-7相关性分析采用Pearson法。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌及癌旁组织中SLC12A5和MMP-7表达比较 SLC12A5在癌旁正常组织中表达-27例，+7例，++3例，+++3例，阳性表达率为32.50%(13/40)；SLC12A5在癌组织中表达-5例，+6例，++11例，+++18例，阳性表达率为87.50%(35/40)；SLC12A5在癌旁正常组织、癌组织中阳性表达率比较差异有统计学意义(χ2=16.275，Plt;0.001)。MMP-7在癌旁正常组织中表达-29例，+6例，++4例，+++1例，阳性表达率为27.50%(11/40)；MMP-7在癌组织中表达-8例，+5例，++12例，+++15例，阳性表达率为80%(32/40)；MMP-7在癌旁正常组织、癌组织中阳性表达率比较差异有统计学意义(χ2=18.744，Plt;0.001)。

2.2 SLC12A5和MMP-7表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系 SLC12A5和MMP-7表达均与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润相关(P均lt;0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度等均无关(P均gt;0.05)，见表1。

2.3 结直肠癌组织中SLC12A5和MMP-7表达的关系 SLC12A5和MMP-7在结直肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.479,P=0.000)。SLC12A5在MMP-7阳性者中的表达(阳性率82.05%)高于MMP-7阴性者(阳性率36.36%)，二者比较，Plt;0.001。

3 讨论

肿瘤发生进展是一个多步骤的遗传及表观遗传学改变累积的过程。拷贝异常(包括染色体的增加和减少，局部的扩增和缺失)在恶性肿瘤中频繁被发现，并已成为癌基因异常活化及抑癌基因失活的主要原因[5]。诸如人染色体18q12.2整体缺失、11q13.3和11q22.3区域缺失、MPL1/PZR基因扩增等拷贝异常与肿瘤临床结局和转移进展密切相关[6]。

SLC12A5是溶质载体家族12亚组中的重要成员之一，定位于人染色体20q13.12，是人类多种恶性肿瘤最常见的扩增区[7]。SLC12A5最初作为一种跨膜氯化钾转运体被发现，这种转运体可维持神经元内外氯平衡，因而最初对SLC12A5的研究仅局限于癫痫等神经系统疾病[8]。而近年来研究发现，SLC12A5突变或异常表达参与某些实体瘤的发生发展。研究[9]表明，SLC12A5抗凋亡作用是通过抑制凋亡诱导因子和核酸内切酶G-依赖的凋亡信号通路介导，而促转移作用是通过调节基质体系结构的关键要素，包括各类基质金属蛋白酶和纤维连接蛋白等。

表1 SLC12A5、MMP-7表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

浸润和转移是恶性肿瘤重要的生物学行为，肿瘤侵袭的三部学说即黏附、降解和转移，MMP-7是重要的蛋白水解酶，MMP-7能降低细胞间的黏附力、打破基质的降解平衡、诱导癌细胞穿透细胞外基质与基底膜构成的屏障，从而使癌细胞向周围组织浸润、侵袭并转移到周围器官[10]；此外，在降解过程中还能诱导细胞释放大量血管内皮生长因子，促进肿瘤新生血管和脉管形成，为肿瘤细胞的增殖与浸润提供必要的营养基础与转移途径[11]。

本研究发现，SLC12A5和MMP-7在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，表明SLC12A5和MMP-7过表达在结直肠癌癌变过程中发挥促进作用，SLC12A5是一种促进结直肠癌发生、发展的致癌基因。进一步研究发现，结直肠癌伴浆膜浸润者较未侵及浆膜者SLC12A5蛋白表达明显增高；伴肝转移、淋巴结转移、脉管浸润者较无转移浸润者SLC12A5和MMP-7蛋白表达增高；TNM分期越高，SLC12A5和MMP-7蛋白表达越高，表明SLC12A5和MMP-7蛋白表达与结直肠肿瘤的恶性生物学行为密切相关，对结直肠癌的侵袭、转移有促进作用。Yu等[12]通过单细胞测序研究发现，突变型SLC12A5在大肠癌患者中呈高表达，而在正常人群中呈低表达，表明突变型SLC12A5在大肠癌中有潜在的致癌作用。进一步研究显示SLC12A5过表达与大肠癌患者生存期显著下降关系密切。Xu等[13]通过基因测序、基因扩增技术发现，SLC12A5与原发性大肠癌的发生密切相关，其能显著促进细胞增殖，诱导细胞周期G1过渡，增强其侵袭、迁移能力。此外，本研究结果显示SLC12A5和MMP-7在结直肠癌组织中的表达呈明显正相关，二者在结直肠癌发生进展过程中有协同作用，但具体机制目前尚不明确。Liu等[14]研究发现，SLC12A5可能作为调节NF-κB信号通路和促进MMP-7增殖的重要因子，促进膀胱肿瘤转移，增强其恶性生物学行为。

总之，SLC12A5异常高表达参与了结直肠癌的发生、演进，其诱导MMP-7过表达可能是促进结直肠癌浸润、转移的重要途径之一。

[1] Tao R, Li C, Newburn EN, et al. Transcript-specific associations of SLC12A5 (KCC2) in human prefrontal cortex with development,schizophrenia,and affective disorders[J]. J Neurosci, 2012,32(15):5216-5222.

[2] Saito T, Ishii A, Sugai K, et al. A de novo missense mutation in SLC12A5 found in a compound heterozygote patient with epilepsy of infancy with migrating focal seizures[J]. Clin Genet, 2017,11(5):2241-2252.

[3] Kursan S, McMillen TS, Beesetty P, et al. The neuronal K+Cl- co-transporter 2 (Slc12a5) modulates insulin secretion[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1732-1740.

[4] Williams KC, McNeilly RE, Coppolino MG. SNAP23,Syntaxin4,and vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) mediate trafficking of membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) during invadopodium formation and tumor cell invasion[J]. Mol Biol Cell, 2014,25(13):2061-2070.

[5] Cornen S, Guille A, Adelaide J, et al. Candidate luminal B breast cancer genes identified by genome, gene expression and DNA methylation profiling[J]. PLoS One, 2014,9(1):e81843.

[6] Van der A, Niels C, Jiqiu M, et al. Genome-wide copy number profiling of single cells in S-phase reveals DNA-replication domains[J]. Nucleic Acids Res, 2013,41(6):e66-e71.

[7] Doshina A, Gourgue F, Onizuka M, et al. Cortical cells reveal APP as a new player in the regulation of GABAergic neurotransmission[J]. Sci Rep, 2017,7(1):370-381.

[8] Merner ND, Chandler MR, Bourassa C, et al. Regulatory domain or CpG site variation in SLC12A5,encoding the chloride transporter KCC2, in human autism and schizophrenia[J]. Front Cell Neurosci, 2015,12(9):386-395.

[9] Caner Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal caner[J]. Nature, 2012,487(11):330337.

[10] Qasim BJ, Ali HH, Hussein AG. Immunohistochemical expression of matrix metalloproteinase-7 in human colorectal adenomas using specifiedautomated cellular image analysis system: a clinicopathological study[J]. Saudi J Gastroenterol, 2013,19(1):23-27.

[11] Yin H, Sheng Z, Zhang X, et al. Overexpression of SOX18 promotes prostate cancer progression via the regulation of TCF1, c-Myc, cyclin D1 and MMP-7[J]. Oncol Rep, 2017,37(2):1045-1051.

[12] Yu C, Yu J, Yao X, et al. Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing[J]. Cell Res, 2014,24(6):701-712.

[13] Xu LX, Li XX, Cai MY, et al. Increased expression of Solute carrier family 12 member 5 via gene amplification contributes to tumour progression and metastasis and associates with poor survival in colorectal cancer[J]. Gut, 2016,65(4):635-646.

[14] Liu JY, Dai YB, Li X, et al. Solute carrier family 12 member 5 promotes tumor invasion/metastasis of bladder urothelial carcinoma by enhancing NF-kappaB/MMP-7 signaling pathway[J]. Cell Death Dis, 2017,8(3):e2691.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.022

R735.3

B

1002-266X(2017)41-0065-03

张家口市科技局指令性计划项目(1621068D)。

李曙光(E-mail:shuguangli6688@126.com)

2017-06-30)