IL-21单独及联合5-FU对人胃癌细胞迁移、凋亡的影响

吴申，娄方方，孙建超，蒋红梅

(1海港医院，山东烟台264000；2贵州省人民医院；3贵州省临床检验中心；4贵州医科大学检验学院)

IL-21单独及联合5-FU对人胃癌细胞迁移、凋亡的影响

吴申1，娄方方2，孙建超3，蒋红梅4

(1海港医院，山东烟台264000；2贵州省人民医院；3贵州省临床检验中心；4贵州医科大学检验学院)

目的探讨人白细胞介素21(IL-21)单独及联合氟尿嘧啶(5-FU)对人胃癌细胞SGC-7901迁移、凋亡的影响。方法取对数期人胃癌细胞SGC-7901，将其随机分为A、B、C、D组。A组加入IL-21 100 ng/mL，B组加入5-FU 25 μg/mL+IL-21 100 ng/mL，C组加入5-FU 50 μg/mL，D组加入5-FU 50 μg/mL+IL-21 100 ng/mL。划痕实验检测各组胃癌细胞迁移能力；TUNEL法检测各组胃癌细胞凋亡情况；Western blotting法检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2及c-myc表达。结果A、B、C、D组人胃癌细胞SGC-7901的迁移能力均受到抑制，迁移距离按A、B、C、D组顺序递减(P均lt;0.001)；D组与A、B、C组相比，24、48 h对肿瘤细胞迁移的抑制作用均增强(P均lt;0.05),IL-21和5-FU联用时，呈协同加强作用。A、B、C、D组凋亡细胞百分比依次递增；D组与C组相比，24、48 h凋亡细胞百分比均增高(P均lt;0.001)；B、C、D组 c-myc蛋白表达呈递增趋势，Bcl-2蛋白表达呈递减趋势；与C组相比，D组24、48 h各凋亡蛋白表达差异有统计学意义(P均lt;0.001)。结论IL-21具有抑制SGC-7901细胞迁移、促进凋亡作用，且与5-FU常规剂量联用时，呈协同加强效应。

胃癌;白细胞介素21;氟尿嘧啶;Bcl-2蛋白;c-myc蛋白

研究表明，恶性肿瘤占人类所有死亡病因的1/4，仅次于心血管疾病，位居第2[1]。我国恶性肿瘤的病死率高于全球平均水平，其中，胃癌是第2位常见的恶性肿瘤死因。目前，手术、放疗和化疗仍是临床治疗胃癌的三大手段[2]。胃癌早期诊断率低，错过了手术治疗的最佳时机，加之Ⅱ期以上患者术后复发率高，长期生存率仍较低[3]。鉴于此，单一手术无法使胃癌患者达到理想的疗效，常需联合放疗和化疗进行综合治疗。目前，化疗药物种类繁多，氟尿嘧啶(5-FU)是治疗胃癌的基本药物及首选药物。进行抗肿瘤新药的研究时，常用5-FU作为阳性药物来评价新药的疗效[4]，但其存在较多的不良反应及对正常细胞的杀伤作用，限制了其临床应用。近几年，分子靶向药物逐渐成为肿瘤治疗的研究热点。研究[5]显示，多种恶性肿瘤中存在细胞因子紊乱，并与肿瘤的发生发展、局部复发及远处转移有关。IL-21是一种具有免疫调节功能的细胞因子，随着研究的深入，IL-21的抗肿瘤作用逐渐被证实。2014年5月～2015年6月，我们观察了IL-21单独及联合5-FU对人胃癌细胞SGC-7901迁移能力及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞SGC-7901(ATCC细胞库)；DMSO(Hyclone公司)；RMPI1640培养基，胎牛血清(Gibco公司)；IL-21(Peprotech公司)；5-FU(Biotopped公司)；TUNEL检测试剂盒(美国罗氏公司)；兔源Bcl-2单克隆抗体，兔源c-myc单克隆抗体(美国Abcam公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)。

1.2 细胞培养 将人胃癌细胞SGC-7901置于含10%胎牛血清的RMPI1640培养液中，37 ℃、5% CO2培养箱中饱和湿度下培养，待细胞生长至对数期时进行实验。将细胞随机分为A、B、C、D组及空白组。

1.3 人胃癌细胞SGC-7901迁移能力检测 按每孔约2×105个SGC-7901细胞接种于6孔板，培养24 h，细胞铺满孔底90%以上时，用10 μL移液器枪头垂直于孔底轻轻划线去除细胞，每孔划2～3条；磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻洗去划落细胞，A组加入IL-21 100 ng/mL，B组加入5-FU 25 μg/mL+IL-21 100 ng/mL，C组加入5-FU 50 μg/mL，D组加入5-FU 50 μg/mL+IL-21 100 ng/mL，空白组不给予任何药物处理，继续培养24、48 h，利用Image J 软件测量不同时间划痕边缘距离。迁移距离=边缘距离(0 h)-边缘距离(24/48 h)。

1.4 人胃癌细胞SGC-7901凋亡检测 A、B、C、D组胃癌细胞分别加入同1.3药物，处理24、48 h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定细胞30～60 min，PBS清洗，细胞通透液处理15 min，PBS清洗，4%多聚甲醛中浸洗5 min，PBS清洗，100 μL平衡液，在湿盒中平衡10 min，加100 μL TUNEL反应混合液，加盖玻片37 ℃暗湿盒中反应1 h，浸入2×SSC 15 min，用PBS洗涤2～3次，浸入0.3%H2O2中15 min，用PBS洗涤2～3次，加入100 μL Streptavidin标记的HRP孵育30 min，加入100 μL DAB混合液显色10 min，去离子水冲洗，苏木素复染3 s后用自来水冲洗，用梯度乙醇脱水(50%、70%、85%、95%、100%、100%各1 min)，二甲苯透明1 min，2次，最后中性树胶封片。光学显微镜下观察凋亡细胞并拍照。

1.5 细胞内Bcl-2、c-myc蛋白表达检测 采用Western blotting法。A、B、C、D组胃癌细胞分别加入1.3中药物处理24、48 h，收集细胞，提取总蛋白，BCA法计算各组蛋白浓度，每组取等量蛋白变性处理后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，湿转PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，兔源一抗Bcl-2(1∶1 000)、c-myc(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶2 500)室温孵育1 h，Tris-HCl缓冲盐溶液清洗后Millipore发光液显色、曝光，利用Image J软件分析，以目的条带和内参条带比值进行半定量分析。

2 结果

2.1 各组不同时点人胃癌细胞SGC-7901迁移距离比较 见表1。

表1 各组不同时点人胃癌细胞SGC-7901迁移距离比较

注： 与空白组相比，aPlt;0.001;与D组相比,bPlt;0.05。

2.2 各组不同时点SGC-7901凋亡细胞百分比比较 见表2。

表2 各组不同时点SGC-7901凋亡细胞百分比

注：与空白组相比，aPlt;0.05；与D组比较，bPlt;0.001；与同组24 h相比，cPlt;0.001。

2.3 各组不同时点SGC-7901细胞凋亡蛋白c-myc、Bcl-2表达比较 见表3。

表3 各组不同时点SGC-7901细胞凋亡蛋白c-myc、Bcl-2表达比较

注：与C组相比，aPlt;0.001；与同组24 h相比，bPlt;0.001。

3 讨论

IL-21具有明确的抗肿瘤作用[6,7]，且不良反应小[8]，但对其抗肿瘤作用的免疫机制尚未完全阐明。目前普遍认为，IL-21可能通过刺激不同时期的NK细胞及T细胞增殖，促进IFN-γ的释放[9]；上调CD8+T细胞、NK细胞颗粒酶和穿孔素的表达，介导细胞毒性T淋巴细胞的活化[10]；直接抑制肿瘤细胞增殖[11]等多种途径发挥抗肿瘤作用。

本实验结果显示，A、B、C、D组人胃癌细胞SGC-7901迁移能力均受到抑制，且抑制作用依次增强；B组较之A组，在24 h时迁移距离缩短，差异有统计学意义，至48 h时，迁移距离仍短于A组。提示IL-21单独使用或与5-FU联合应用对人胃癌细胞SGC-7901的迁移都有明显抑制作用，但与5-FU联用效果更佳。

肿瘤细胞无限增殖是肿瘤发生发展的关键。本研究结果显示，A、B、C、D组人胃癌细胞SGC-7901凋亡细胞百分比依次递增；D组与C组相比，24、48 h凋亡细胞百分比均明显增加；B组在24、48 h与C组相比凋亡细胞百分比较低，但48 h时，两组之间差异较小。表明二者联合时可起到协同加强作用，这对临床减少5-FU毒性作用有积极作用。

细胞凋亡受多种基因调控，主要包括p53、Bcl-2及c-myc。其中c-myc为促细胞凋亡基因；Bcl-2为抑制细胞凋亡基因，高表达时可明显延长细胞的生长周期，抑制细胞凋亡。c-myc与Bcl-2协同作用时可封闭p53蛋白进入细胞核中，从而阻断p53诱导的细胞凋亡，导致肿瘤细胞向恶性表型进展，并使肿瘤细胞对治疗的抗性增加[12,13]。本研究结果显示，B、C、D组c-myc蛋白表达呈递增趋势，Bcl-2蛋白表达呈递减趋势；与C组相比，B组24、48 h两个时点各凋亡蛋白表达差异有统计学意义，但48 h时两组c-myc、Bcl-2蛋白表达量差异较24 h时已有所缩小。提示IL-21与5-FU联用对SGC-7901细胞的凋亡均有促进，可使胃癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低，c-myc表达增加；与单用 5-FU相比，IL-21联合5-FU对肿瘤细胞的凋亡呈协同促进作用。

综上所述，IL-21可抑制人胃癌细胞SGC-7901迁移，促进其凋亡；IL-21与5-FU常规剂量联用时，上述作用协同加强，有利于提高单纯使用5-FU的抗肿瘤效果。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.013

R735.2

A

1002-266X(2017)41-0042-03

蒋红梅(E-mail：1933769985@qq.com)

2017-05-28)