IKCa1通道对HeLa细胞迁移、侵袭及miRNA表达谱的影响

程慧，高兰阳，詹平，毛熙光

( 西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

IKCa1通道对HeLa细胞迁移、侵袭及miRNA表达谱的影响

程慧，高兰阳，詹平，毛熙光

( 西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

目的探讨钙激活钾离子(IKCa1)通道对宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭及miRNA表达谱的影响。方法取生长期HeLa细胞，随机分为观察1～5组及DMSO组，分别给予0、10.0、20.0、30.0、40.0 μmol/L TRAM-34及等体积DMSO(TRAM-34溶剂)处理24、48和72 h，用划痕实验检测HeLa细胞迁移特性；用Transwell侵袭实验检测48 h细胞侵袭特性。用高通量测序法检测IKCa1通道阻断前后miRNA 表达谱的差异，并用qRT-PCR法对部分差异表达miRNAs进行验证。运用miRanda软件预测差异miRNA可能调控的靶基因，并对这些靶基因进行通路富集分析。结果划痕实验，TRAM-34干预后HeLa细胞迁移受抑制，随着TRAM-34浓度增加及作用时间延长，抑制迁移作用越明显(Plt; 0.001)。Transwell侵袭实验显示，HeLa细胞的侵袭率随TRAM-34浓度增加呈递减趋势(F=384.050，Plt;0.001)。通过高通量测序筛选出15个差异有统计学意义而表达上调的miRNA，5个表达下调的miRNA。qRT-PCR结果显示差异性miRNA 的表达趋势与测序结果一致。生物信息学分析发现，hsa-miR-143-5p的靶基因在癌症相关通路、p53基因信号通路及MAPK信号通路上出现聚集; 而hsa-miR-421的靶基因在肿瘤蛋白多糖、Rap1信号通路和Wnt信号通路出现聚集。结论阻断IKCa1通道可抑制HeLa细胞迁移和侵袭，影响miRNAs表达谱。

宫颈肿瘤；HeLa细胞；IKCa1通道；细胞迁移；侵袭；微小RNA

宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，近年发病呈年轻化趋势[1]。钙激活钾通道(IKCa1)在人体广泛分布，通过影响细胞内钙离子浓度和细胞膜电位，参与细胞间信号传递、基因表达与调控,其异常高表达与肿瘤发生发展相关。目前证实IKCa1在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌和肝细胞癌等恶性肿瘤组织中高表达[2，3]，参与肿瘤细胞的增殖和转移[4]。我们前期研究发现，IKCa1通道在宫颈癌组织及细胞中呈高表达，且与宫颈癌细胞增殖、细胞周期有关[5]，但IKCa1通道是否与宫颈癌细胞迁移和侵袭相关，目前尚未见报道。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码小RNA，在转录后水平调节靶基因表达。2016年4～10月，我们探索IKCa1通道对HeLa细胞迁移、侵袭及miRNA表达谱的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌 HeLa 细胞株(医学实验中心，西南医科大学);胎牛血清(四季青，杭州);PMI1640、DMEM(Gibco，美国)：IKCa1通道的特性阻断剂TRAM-34(Sigma，美国)；Transwell小室 (Corning，美国)、Matrigel胶(Bamp;D Biosciences，美国)，TRIzol试剂(Invitrogen，美国)，Dnase I(Qiagen，德国)，SYBR PrimeScript miRNA RT- PCR(Takara，日本)，Small RNA Smaple Prep 文库构建试剂盒(Illumina，美国)，RNA提取试剂盒、dNTP mix(天根，北京);M-MLV逆转录酶购于TOYOBO；RNase inhibitor(Thermo Scientific，美国)；iQTM SYBR®Green Supermix(Bio-Rad，美国)；常规生物化学试剂(Corning，美国)。

1.2 HeLa细胞分组及迁移实验 设置观察1、2、3、4、5组及DMSO组，观察1、2、3、4、5组分别给予0、10.0、20.0、30.0、40.0 μmol/L TRAM-34，DMSO组给予等体积的DMSO(TRAM-34溶剂)，分别配置培养基。取对数期HeLa细胞接种于6孔板内，约1.0×105/mL，细胞贴壁生长24 h后铺满培养孔底部。用无菌200 μL枪头在6孔板内等距划3条平行线，去除原培养基，加入配好上述6个组培养基，每组设置 3个复孔，置于恒温箱中培养。在干预的第0、24、48和72小时分别取出各组细胞进行拍照、测量划痕距离，并计算实际迁移距离。

1.3 细胞侵袭实验 HeLa细胞帖壁生长后更换为1.2中6组培养基培养48 h，消化，用DMEM重悬为2×105/mL的单细胞悬液。小室铺好Matrigel基质胶后，上室加入细胞悬液100 μL，下室加入500 μL 2%胎牛血清的DMEM培养基，整个过程在冰上操作。置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h后取出细胞。用棉签擦去滤膜上表面未穿透的细胞，对已穿透的细胞进行伊红染色。倒置差显微镜观察、拍照并计数。每个样本均计数5个200倍高倍镜视野。以各组细胞穿过Transwell小室的数量作为评价其侵袭能力的指标。

1.4 样本总RNA提取、分离、测序文库的构建及测序 根据1.2及1.3中6组的划痕实验及Transwell实验结果，取对数生长期的HeLa细胞，分别加入观察1组和观察4组的TRAM-34处理细胞48 h，TRIzol法提取标本总RNA，所有步骤严格按说明书操作。提取的总RNA进行质检，总RNA的OD260 /OD280值接近2∶1，OD260 /OD230值gt;1.8。说明制备RNA纯度较高。样本总RNA提取电泳结果显示28 S和18 S条带清晰可见，说明所提取的RNA无明显降解，样品检测合格。每例样本取2 μg总RNA进行15%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后对18～35 nt片段进行切割、洗脱、纯化回收。采用Illumina公司的Small RNASample Prep Kit 构建小RNA文库。利用Small RNA的3′及5′端特殊结构，以total RNA为起始样品，直接将Small RNA两端加上接头，然后反转录合成cDNA后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离目标DNA片段。原始序列经过处理后，观察1组和4组所获得的可用于分析的小RNA序列数量分别为10 355 783和11 680 732条。所获得的序列长度主要集中于22～24 nt，说明测序获得的序列质量较高，可用于后续的生物信息学分析。

1.5 小RNA数据处理和miRNA差异表达分析 测序所得长度为51 nt的小RNA序列通过去接头、去除低质量和污染序列，最终获得22～24 nt的高质量小RNA序列。采用Bowtie软件将所得小RNA序列与参考基因组进行比对分析，再将匹配序列分别与RepBase18.07数据库进行对比，筛选出miRNA序列并分类注释，将样本中的miRNA表达量标准化为 TPM，应用DEGseq软件对2组样本已知miRNA差异表达进行分析统计。差异miRNA筛选条件：将差异倍数≥1.5且Plt;0.05的miRNA定义差异表达的miRNA。

1.6 差异表达 miRNA 的验证 应用qRT-PCR对5个显著性差异表达的miRNA进行检测，验证高通量测序结果的可信性。rRNA U6作为内参，miRNA检测用的正向特异性引物由广州锐博生物科技有限公司合成，反向引物为试剂盒中特有。扩增条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s； 60 ℃ 30 s；70 ℃ 1 s；读板；40 个循环。PCR结果采用2-ΔΔCt法计算相对表达值。实验重复3次。

1.7 靶基因生物信息学分析 用靶基因预测软件miRanda对hsa-mi-451a、hsa-miR-143-5P、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-421的靶基因进行预测及靶点确认。挑选的数据库分别为miRanda、Pictar、PITA、TargetScan。根据miRNA与其靶基因间的对应关系，挑选hsa-miR-143-5P和hsa-miR-421作为差异显著miRNA上调和下调的代表。通过 KEGG 数据库对其预测靶基因的信号通路进行富集分析，以U6为内参。

2 结果

2.1 各组不同时点HeLa细胞迁移实际距离比较 不同浓度TRAM-34作用后HeLa细胞迁移受到抑制，在一定范围内呈时间和浓度依赖关系(Plt;0.05)。见表1。

表1 TRAM-34对HeLa细胞迁移的影响

注：与DMSO组相比，*Plt;0.001。

2.2 各组HeLa细胞侵袭能力比较 培养48 h后，细胞侵袭率随TRAM-34浓度增加呈递减趋势。DMSO组、观察1～5组穿过Transwell小室基底膜的细胞数分别为(127±4.40)、(130±3.58)、(100+4.40)、(83±6.26)、(56±3.10)、(44±5.05)个/HP,观察2～5组培养48 h后穿过Transwell小室基底膜的细胞数相对于观察1组及DMSO组明显减少，且随浓度增加，穿过的细胞数逐渐减少，差异有统计学意义(F=384.05,Plt;0.01)；观察1组及DMSO组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

2.3 差异性表达 miRNAs 分析 加药组(观察4组)共得1 057个 miRNAs成熟体序列，观察1组共得1 039个miRNAs成熟体序列。两组871种 miRNAs共同表达，本实验对miRNA差异表达的判断标准为Plt;0.05，通过校正后的观察4组与观察1组样品间表达倍数gt;1.5( 表达上调) 、lt;-1.5(表达下调)。进一步分析结果显示20个miRNAs呈显著性差异表达。在差异性表达的miRNAs中，15种miRNAs表达上调，包括hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-451a、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-378d，5种miRNAs表达下调，包括hsa-miR-3529-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-4521、hsa-miR-421、hsa-miR-27b-5p。

2.4 qRT-PCR 验证 qRT-PCR对4个上调表达的miRNAs(hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P)和1个下调的hsa-miR-421进行验证。结果显示hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P、hsa-miR-421相对表达量分别为1.128±0.121、1.178±0.063、1.261±0.228、0.906±0.194、0.737±0.124，变化趋势与高通量测序的结果基本一致(P均lt;0.05)，进一步证实高通量测序结果的准确性。

2.5 hsa-miR-143-5P和hsa-miR-421靶基因生物信息学预测 hsa-miR-143-5P和hsa-miR-421作为显著差异miRNA表达上调和下调的代表，应用在线靶基因预测软件miRanda对其可能的靶基因进行预测后，对这些基因进行信号通路分析,发现hsa-miR-143--5P靶基因在肿瘤蛋白多糖(4个基因)、癌症相关通路(53个基因)、p53基因信号通路(18个基因)及MAPK信号通路( 10 个基因)上出现聚集;而hsa-miR-421靶基因在肿瘤蛋白多糖(23个基因) 、Rap1信号通路 (99个基因)和 Wnt 信号通路(70个基因)出现聚集。

3 讨论

人类miRNA控制着约60%的蛋白编码基因表达，而且编码的基因一半以上均位于已知肿瘤相关的基因缺失、扩增、转位的高发区域或脆性位点[6]。miRNA具有肿瘤抑癌基因及癌基因的作用，一个miRNA可调节多个靶基因，一个靶基因可受多个miRNA的调节。部分蛋白及转录因子会负向调控miRNA，参与肿瘤的细胞分化成熟障碍、增殖、侵袭转移、细胞永生化等恶性转化过程。

IKCa1是钙激活钾通道家族中的重要成员之一，在调节细胞生理功能和细胞分子信号转导通路中发挥重要作用。近年来研究证实，IKCa1参与多种恶性肿瘤发生发展过程。Haren等[7]发现，IKCa1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高表达，与乳腺癌分期、分化程度及转移密切相关。Zhang等[8]用TRAM-34阻断IKCa1通道后抑制子宫内膜癌细胞迁移和侵袭。我们前期研究中不仅证实IKCa1通道在宫颈癌组织中高表达，与宫颈癌细胞增殖、细胞周期及凋亡有关[5]，而且还证实miR-497-5p是IKCa1通道的靶基因，miR-497-5p可能通过下调IKCa1通道表达抑制HeLa细胞增殖[9]。IKCa1通道是否与宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭有关及其相关机制鲜见报道。

本研究结果显示，IKCa1通道活性状态与宫颈癌HeLa细胞迁移有关，且呈剂量-时间效应关系；当TRAM-34浓度达到30.0 μmol/L时，在24、48和72 h HeLa细胞的迁移能力出现抑制，差异有统计学意义。表明当TRAM-34处理浓度达到30.0 μmol/L时，细胞侵袭能力抑制效果最明显。我们选择TRAM-34 30 μmol/L、处理时间48 h作为高通量测序的处理条件，观察IKCa1通道阻断前后miRNAs表达谱变化。qRT-PCR验证基本证实高通量测序的准确性。在IKCa1通道相关的差异表达miRNAs中，has-miR-143-3p和has-miR-421与肿瘤发生发展有关。Zhang 等[10]发现宫颈癌中miRNA-143低表达可增强HeLa细胞的侵袭、迁移和改变Vimentin和E-cadherin表达。Li 等[11]发现通过miR-421高表达下调肿瘤抑制因子而促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。而本次实验中发现阻断IKCa1通道后has-miR-143-3p显著上调，has-miR-421显著下调，而对照组中则相反。推测miR-143-3p在宫颈癌发生发展中扮演抑癌基因，而miR-421则扮演癌基因角色。这些差异表达的miRNA与IKCa1通道活性状态密切相关。

本研究进一步应用KEGG数据库对miR-143-3p和miR-421靶基因信号通路进行富集分析。miR-143-5P靶基因在肿瘤蛋白多糖、癌症相关通路、p53基因信号通路及MAPK信号通路上出现聚集;而miR-421靶基因在肿瘤蛋白多糖、Rap1信号通路和Wnt信号通路出现聚集。其中MAPK信号通路在细胞凋亡、增殖、基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。Li等[12]发现低温等离子可通过抑制MAPK通路及抑制MMP9表达来抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭。Lan等[13]现SRX通过激活Wnt/β-Catenin 信号通路促进宫颈癌细胞转移。我们所筛选的miR-143-3p及miR-421在MAPK/Wnt信号通路中富集有统计学差异。本实验中IKCa1通道阻断后引起miR-143-3p明显上调及miR-421明显下调，推测miR-143-3p及miR-421可能参与IKCa1通道高表达引起宫颈癌HeLa细胞转移和侵袭的一种或多种信号通路中，但其调控的确切靶基因及其生物学功能尚有待进一步研究证实。

综上所述，IKCa1通道能促进HeLa细胞的迁移和侵袭，并改变细胞内miRNAs的表达谱。

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EffectsofIKCa1channelsonmigration,invasion,andmiRNAexpressionprofileofhumancervicalcancerHeLacells

CHENGhui,GAOLanyang,ZHANPing,MAOXiguang

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of IKCa1 channels on the migration, invasion, and miRNA expression profile of cervical cancer HeLa cells.MethodsHeLa cells in the logarithmic phase were randomly divided into the observation groups 1-5 and the DMSO group, which were then treated with 0, 10.0, 20.0, 30.0, and 40.0 umol/L TRAM-34 (a characteristic inhibitor of IKCa1 channel), and equal volume of DMSO (TRAM-34 solvent), respectively, for 24, 48 and 72 h. The migration characteristics of HeLa cells were detected by Scratch test. Transwell invasion assay was used to detect invasive properties. The miRNA expression profile of IKCa1 channel was detected by high-throughput sequencing, and some differentially expressed miRNAs were verified by qRT-PCR. The miRanda software was used to predict the target genes that could differentiate miRNAs and underwent signal pathway enrichment analysis.ResultsScratch test suggested that TRAM-34 inhibited the migration of HeLa cells, with a concentration- and time-dependent manner (Plt;0.001). Transwell invasion showed that the invasion rate of HeLa cells decreased with the increase of TRAM-34 concentrations (F=384.050,Plt;0.001). High-throughput sequencing revealed 15 differentially expressed and up-regulated miRNAs and 5 down-regulated miRNAs. The results of qRT-PCR showed that the differential expression of miRNAs was consistent with the sequencing results. Bioinformatics analysis showed that the target gene of hsa-miR-143-5p aggregated in the cancer-related pathways, p53 gene pathway, and MAPK signal pathway, while the target gene of hsa-miR-421 aggregated in the tumor proteoglycans, Rap1 signal pathway, and Wnt signaling pathway.ConclusionBlocking IKCa1 channel can inhibit the migration and invasion of HeLa cells and influence the miRNAs expression profile.

cervical neoplasms; HeLa cells; IKCa1 channel; migration; invasion; microRNA

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.007

R737.33

A

1002-266X(2017)41-0024-04

四川省卫生厅科研课题(110373)。

程慧(1991-)，女，硕士研究生，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail:1624590966@qq.com

2017-07-25)