非小细胞肺癌组织中DNMT1表达和hMLH1、hMSH2甲基化状态的变化及意义

刘俊，孙宇，王延宁，刘文洲，周华富

(1广西医科大学第一附属医院，南宁 530021;2广西医科大学第二附属医院)

非小细胞肺癌组织中DNMT1表达和hMLH1、hMSH2甲基化状态的变化及意义

刘俊1，孙宇2，王延宁1，刘文洲2，周华富1

(1广西医科大学第一附属医院，南宁 530021;2广西医科大学第二附属医院)

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)癌及癌旁组织中DNMT1表达和hMLH1、hMSH2基因甲基化状态的变化及意义。方法通过实时荧光定量PCR法检测52例肺癌及癌旁组织中DNMT1表达，同时用甲基化特异性PCR(MSP)法检测hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态。DNMT1表达与hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平相关性用Spearman相关分析。结果52例NSCLC患者癌及癌旁组织中DNMT1 mRNA相对表达量分别为3.162 3±0.512 5、2.873 1±0.370 6，Plt;0.01；癌及癌旁组织中hMLH1基因启动子区甲基化阳性率分别为53.8%(28/52)、32.7%(17/52)，差异有统计学意义(χ2=4.740，Plt;0.05)；癌及癌旁组织中hMSH2基因启动子区甲基化阳性率分别为57.7%(30/52)、34.6%(18/52)，差异有统计学意义(χ2=5.571，Plt;0.05)。hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理学类型、淋巴结转移、侵犯周围组织等无关(P均gt;0.05)。DNMT1表达与hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平呈显著正相关(r分别为0.479、0.528，P均lt;0.05)。结论NSCLC癌组织中DNMT1呈高表达，DNMT1表达与hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化水平呈正相关性；三者表达与NSCLC患者临床病理特征无关。

癌,非小细胞肺;DNA甲基化转移酶1;hMLH1基因;hMSH2基因;甲基化

近年来，肺癌发病率、病死率呈急剧上升趋势[1]，NSCLC的发生发展是多基因表达调控失衡的共同结果，研究认为抑癌基因异常甲基化是其发展的重要因素，DNA甲基转移酶(DNMT)具有胞嘧啶甲基转移活性，可通过调节细胞内甲基化过程而参与肿瘤的发生发展[2]，其中DNMT1是催化基因甲基化的关键酶；而抑癌基因hMLH1、hMSH2对基因错配修复起重要作用。2016年9月，我们通过荧光定量PCR及甲基化特异性PCR(MSP)检测DNMT1的表达和hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态，并进一步探讨其意义，从而为肺癌标志物筛选及早期诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集广西医科大学第一附属医院胸外科2015年11月～2016年6月接受手术切除且经病理确诊的52例非小细胞肺癌患者，男30例、女22例，年龄38～75(58.7±8.2)岁。癌组织取自手术切除肿块中心非坏死组织，癌旁组织取自距肿块边缘至少5 cm处，组织离体后均于30 min内置-80 ℃冰箱保存，患者术前均未行放化疗且无其他部位肿瘤病史，均经术后常规病理检查。患者均签署知情同意书。

1.2 DNMT1在肺癌及癌旁组织中的表达检测 采用Real-time PCR法。总RNA提取：应用TRIzol试剂从肺癌及癌旁组织中提取总RNA，提取的基因组RNA应用紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度，随后立即行反转录反应。Real-time PCR：逆转录反应采用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，按照试剂盒说明书进行操作，cDNA第一链合成后-20 ℃保存备用。荧光定量时取100 ng的cDNA行荧光定量PCR。同时在反应体系中加入GAPDH引物作为内参照。DNMT1正向引物：5′-TGGAGATCAAGCTTTGTATGTTGG-3′，反向引物：5′-CACATGTGAACGGACAGATTGAC-3′，扩增产物长度178 bp。GAPDH正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增产物长度129 bp。反应体系为20 μL，含有10 μL的SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×)、0.8 μL的PCR Forward Primer(10 μmol/L)、0.8 μL的PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、cDNA模板2 μL、0.4 μL的ROX Reference Dye Ⅱ(50×)、加ddH2O补齐至20 μL。PCR条件:预变性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s ，60 ℃ 34 s ，40个循环；熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。DNMT1相对表达量用2-△△Ct表示。

1.3 hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态检测 采用MSP法。组织DNA提取：应用天根生化科技有限公司组织基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，提取的基因组DNA，应用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度，置于-80 ℃冰箱保存备用。甲基化特异性PCR：取1 μg DNA 行亚硫酸氢盐修饰，-80 ℃保存，时间不超过1个月。参考相关文献合成hMLH1、hMSH2基因甲基化和非甲基化引物，参照Herman等[3]的方法行MSP。hMLH1甲基化引物：正向引物：5′-ACGTAACGTTTTATTAGGGTCGC-3′，反向引物：5′-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3′，扩增产物长度115 bp。hMLH1非甲基化引物：正向引物：5′-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTG-3′，反向引物：5′-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3′，扩增产物长度124 bp。hMSH2甲基化引物：正向引物：5′-TCGTGGTCGGACGTCGTTC-3′，反向引物：5′-CAACGTCTCCTTCGACTACACCG-3′，扩增产物长度132 bp。hMSH2非甲基化引物：正向引物：5′- GGTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT-3′，反向引物：5′-CAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA-3′，扩增产物长度143 bp。PCR反应体系内含MSP DNA Polymerase(2.5 U/μL) 1 U、dNTPs(2.5 mmol/L) 1.6 μL、10×MSP PCR Buffer 2 μL、正反向引物各 1 μL(10 μmol/L)和模板DNA 2 μL，以去离子水补足至20 μL。循环参数：95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 5 min。每例标本设3个复孔。以经CpG甲基转移酶处理后行亚硫酸氢盐修饰的肺组织DNA作为甲基化阳性对照，以经亚硫酸氢盐修饰的正常人肺组织DNA作为甲基化阴性对照，用水代替模板DNA作为空白对照。取9 μL MSP产物，加入1 μL 10×Loading Buffer，于含0.5 mg/L溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统拍照观察。如hMLH1基因启动子区的CpG岛完全甲基化，则只有甲基化引物能扩增出目的条带；如完全未甲基化，则只有非甲基化引物能扩增出目的条带；如为部分甲基化，则两对引物均能扩增出目的条带。部分甲基化归为甲基化范畴。

2 结果

2.1 DNMT1 mRNA在癌和癌旁组织中的表达比较 DNMT1基因扩增曲线和溶解曲线表明Real-time PCR扩增产物具有特异性。癌组织与癌旁组织中DNMT1 mRNA相对表达量分别为3.162 3±0.512 5、2.873 1±0.370 6，P=0.001；DNMT1 mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理学类型、淋巴结转移、侵犯周围组织等临床病理特征无关(P均gt;0.05)。

2.2 hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态 MSP结果显示，52例非小细胞肺癌患者癌组织中28例(53.8%)hMLH1基因启动子区甲基化阳性，30例(57.7%)hMSH2基因启动子区甲基化阳性；癌旁组织中17例(32.7%)hMLH1基因启动子区甲基化阳性，18例(34.6%)MSH2基因启动子区甲基化阳性。癌组织与癌旁组织中hMLH1、hMSH2基因甲基化阳性率差异有统计学意义(χ2=4.740，P=0.029；χ2=5.571，P=0.018)。17例(32.7%)癌组织中hMLH1、hMSH2基因启动子区同时发生甲基化，11例(21.2%)仅hMLH1基因发生甲基化，13例(25.0%)仅hMSH2基因发生甲基化，11例(21.2%)两基因启动子区均未发生甲基化。癌组织中hMLH1、hMSH2基因甲基化阳性率差异无统计学意义(χ2=0.227，P=0.779)。hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理学类型、淋巴结转移、侵犯周围组织等临床病理特征无关(P均gt;0.05)，见表1。

2.3 hMLH1、hMSH2启动子甲基化状态与DNMT1表达的相关性 Spearman相关性分析结果显示，DNMT1表达与hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平呈正相关(r分别为0.479、0.528，P均lt;0.05)。

3 讨论

DNA甲基化为DNA复制后发生的共价修饰，指在DNA甲基化转移酶的催化下将甲基转移给胞嘧啶5′端的碳原子，形成甲基化的胞嘧啶[4]，从而阻碍转录因子与启动子结合，抑制转录[5]。目前发现的DNA甲基化转移酶主要有DNMT1、DNMT2、DNMT3a/3b三类，其中DNMT1在DNA复制、修复并维持其正常甲基化中起重要作用。DNMT1表达增高可使甲基化模式发生异常，引起抑癌基因沉默、原癌基因激活从而导致肿瘤发生[6]。Lin等[7]研究表明DNMT1蛋白表达增高与多种肿瘤组织中抑癌基因启动子区的高甲基化密切相关。Tang 等[8]报道肺癌中经常出现CDH1、p16、p53、PTEN、RB、APC[9]等多种抑癌基因的甲基化和失活。

表1 hMLH1、hMSH2基因甲基化状态与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

hMLH1、hMSH2是DNA错配修复系统(MMR)中的重要成员，担负着对错配位点的识别和切除功能，除了有防止自发突变的堆积，还具有维持DNA高保真度复制的作用。hMLH1、hMSH2作为重要的抑癌基因，其失活或低表达可能引起机体MMR系统功能降低，导致体内癌基因和抑癌基因在复制过程中发生突变，进而引起肿瘤发生发展。大量研究发现，hMLH1、hMSH2不仅与遗传性非息肉性直肠癌发病有关，还与胃癌、直肠癌、宫颈癌等其他肿瘤的发生发展有密切关系。Xinarianos 等[10]对147例肺癌组织进行免疫组化检测发现85例(57.8%)hMSH2低表达，88例(58.6%)hMLH1低表达。

本研究发现DNMT1 mRNA在52例NSCLC癌组织中的表达高于癌旁组织，与Zhou 等[11]研究结果相似，说明DNMT1在肺癌组织中呈过表达，是肺癌发生发展过程中的重要因素。DNMT1表达与肺癌组织学类型、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移及侵犯周围组织等临床病理特征无关，与刘树立等[12]研究结果有差异，可能由于DNMT1在转录和翻译过程中存在其他基因或通路影响其蛋白表达，如MGMT、HDAC等。MSP检测结果显示，癌组织中hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化阳性率均明显高于相应癌旁组织，差异有统计学意义，与Wang等[13]研究结果一致，表明NSCLC中错配修复基因hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平升高，基因失活无法进行翻译以致肺癌的发生。相关分析发现，DNMT1表达与hMLH1、hMSH2启动子区甲基化水平呈正相关，表明DNMT1可能通过甲基化机制来调控抑癌基因hMLH1、hMSH2启动子区甲基化，从而引起hMLH1、hMSH2基因的沉默和失活，进一步降低其翻译和表达。Qi 等[14]研究发现膀胱癌组织中DBCCR1低表达与DNMT1高表达间存在相关性，DBCCR1通过DNMT1介导的DBCCR1启动子区甲基化而被直接抑制。Moghbeli 等[15]研究发现51例胃癌患者(25.5%)中13例在hMLH1启动子序列中表现出高甲基化，甲基化状态与肿瘤的分期显著相关。

综上所述，在NSCLC中抑癌基因hMLH1、hMSH2存在过甲基化现象，而DNMT1作为重要的甲基化转移酶在其中发挥重要作用，是导致其过甲基化的重要原因。本研究提示DNMT1表达及hMLH1、hMSH2甲基化检测可能对肺癌标志物的筛选及早期诊断提供帮助,但三者表达与NSCLC患者临床病理特征无关。本研究存在局限性，仅检测DNMT1的mRNA转录水平和hMLH1、hMSH2的甲基化水平，后续本课题组将扩大样本量，并进一步对其蛋白表达进行检测。

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ExpressionofDNMT1andthemethylationstatusofhMLH1andhMSH2innon-small-celllungcancer

LIUJun1,SUNYu,WANGYanning,LIUWenzhou,ZHOUHuafu

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo investigate the DNA methyltransferase 1 (DNMT1) expression and the changes in the methylation status of hMLH1 and hMSH2 genes in the tumor tissues and adjacent tissue specimens of non-small-cell lung cancer (NSCLC).MethodsThe expression of DNMT1 in 52 lung cancer specimens and adjacent tissue specimens was detected by real-time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR). Meanwhile, promoter methylation status of hMLH1 and hMSH2 was detected by methylation-specific PCR (MSP). Correlation of DNMT1 expression with methylation of hMLH1 and hMSH2 genes was analyzed by Spearman correlation analysis.ResultsThe expression of DNMT1 mRNA in 52 cases of NSCLC specimens and adjacent tissue specimens was 3.162 3±0.512 5 and 2.873 1±0.370 6 (Plt;0.001). The positive rate of promoter methylation of hMLH1 in the lung cancer specimens was higher than that in the adjacent tissue specimens [53.8%(28/52) vs. 32.7% (17/52),χ2=4.740,Plt;0.05]. The positive rate of promoter methylation of hMSH2 in the cancer specimens was higher than that in the adjacent tissue specimens [57.7%(30/52) vs. 34.6%(18/52),χ2=5.571,Plt;0.05]. Methylation status of hMLH1 and hMSH2 was not correlated with the patients' gender, age, tumor size, pathological types, lymph node metastasis, and invasion of surrounding tissues (allPgt;0.05). The expression of DNMT1 was positively correlated with the methylation level of hMLH1 and hMSH2 (r=0.479, 0.528, allPlt;0.05).ConclusionDNMT1 is highly expressed in the NSCLC tissues and the DNMT1expression is positively correlated with the promoter methylation levels of hMLH1 and hMSH2 genes, and the expression of these three parameters is not correlated with the clinicopathological features of NSCLC.

non-small-cell lung cancer; DNA methyltransferase 1; hMLH1gene; hMSH2 gene; methylation

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.006

R734.2

A

1002-266X(2017)41-0020-04

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻14124004-1-4)。

刘俊(1991-)，男，硕士，主要研究方向为肺癌发病机制及早期诊断的研究。E-mail:472210765@qq.com

周华富(1964-)，男，博士，主任医师，主要研究方向为肺癌发病机制及早期诊断的研究。E-mail:zhouhuafudr@sina.com

2017-08-10)