基于UHPLC-Q-TOF/MS的不同产地普洱生茶化学成分差异研究

杨晨，戴伟东，吕美玲，李朋亮，刘栩，田军，万云龙，李继，林智

1. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室；中国农业科学院茶叶研究所 浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3. 安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102；4. 昆明七彩云南庆沣祥茶业股份有限公司，云南 昆明 650501

基于UHPLC-Q-TOF/MS的不同产地普洱生茶化学成分差异研究

杨晨1,2，戴伟东1*，吕美玲3，李朋亮1,2，刘栩1，田军4，万云龙4，李继4，林智1*

1. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室；中国农业科学院茶叶研究所 浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3. 安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102；4. 昆明七彩云南庆沣祥茶业股份有限公司，云南 昆明 650501

为了更加全面地了解产地对普洱生茶品质与化学成分的影响，本研究选取来自临沧市、普洱市、西双版纳州三大产区 12个茶山（自然村）的普洱生茶样品，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）对不同产地普洱生茶的非挥发性代谢物表型进行了研究。结果表明：不同产地普洱生茶的化学成分在含量上具有较大差异，且具有明显的产地特征。采用主成分分析，可以对来自西双版纳自治州（包括勐腊县、勐海县、景洪市）、普洱市、临沧市3个地级行政区的普洱生茶进行有效区分，也可以对来自普洱茶产区的东南、西南、西北3个区域的普洱生茶进行有效区分。进一步鉴定了普洱生茶中79种主要成分，并对其在12个茶山（自然村）的普洱生茶中的含量分布，以及与不同产地普洱生茶滋味品质的关系进行了分析。本研究表明，基于UHPLC-Q-TOF/MS的茶叶非挥发性化学成分轮廓可以作为普洱生茶产地判别的依据。

普洱生茶；产地；化学成分；液质联用；代谢组学；滋味

普洱茶是以云南特色大叶种[Camellia sinensisvar. assamica(Mast.) Kitamura]晒青茶为原料，采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶，也是我国特有的茶类[1]。普洱茶以其良好的降血脂[2]、降胆固醇[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗突变[6]、减肥[7]、抑制神经损伤[8]的保健作用而广受消费者喜爱。按其加工工艺及品质特征，普洱茶可分为普洱熟茶和普洱生茶两种类型[1]。前者经特殊工序“后发酵”，其内含物质发生一系列转化，进而形成独特的“醇和、陈香”风味品质[9]。后者是以晒青茶经精制、蒸压成型工序而成，其品质特征与绿茶有相近之处[10-11]。

茶树种植有较强的地域性，受气候、土壤等环境影响，茶叶的香气、滋味品质特点差异较大。云南以其独特的地理、生态环境，孕育着丰富的茶树物种资源，并有茶树天然基因库的美誉[12]。根据2008年发布的普洱茶国家标准 GB/T 22111—2008《地理标志产品 普洱茶》，普洱茶产地主要包括云南省普洱市、西双版纳州、临沧市、昆明市、大理州等11个州市、75个县、639个乡镇[1]。各地气候、土壤环境及茶树品种的差异使得其普洱茶化学成分及品质特征有所不同。已有研究表明，不同产地普洱茶在感官品质[13]、水浸出物[14]、茶多酚类[15]、咖啡碱[16]、没食子酸[17]、挥发性成分[18-19]上存在一定差异。但这些研究仅是对比了少数地域样本，且测定多围绕常规化学成分进行，缺乏对不同产地普洱茶化学成分差异的全面系统研究。近年来，代谢组学以其具有高效、全面及准确的特点，广泛应用于植物[20]、医药[21]、微生物[22]、食品[23]等研究领域，并取得较大进展。目前，基于代谢组学的茶叶品质特征与化学成分相关性研究也成为茶叶研究热点之一。

为更全面了解产地对普洱生茶品质与化学成分的影响，本研究选取了来自临沧、普洱、西双版纳三大产区12个茶山（自然村）的普洱生茶样品，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）对不同产地普洱生茶的非挥发性代谢物表型进行研究分析，同时采用国标法进行感官评定。旨在探索不同产地普洱生茶化学成分及滋味品质特征差异，并为普洱茶产地判定研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验样本与试剂

1.1.1 实验样本

本研究采用的12个茶山（自然村）的普洱生茶样本均由昆明七彩云南庆沣祥茶业股份有限公司提供（表1）。所有样本均为2016年春季收集每个茶山（自然村）多个大叶种晒青毛茶茶样（按一芽二三叶标准收集）经匀堆混合形成每个茶山（自然村）各自综合样。茶样按普洱生茶工艺“采摘—摊放—杀青—揉捻—晒干—蒸压—干燥”加工而成。

1.1.2 试剂

实验用水为Milli-Q超纯水；LC-MS级甲醇（99.9%）购于美国 Merck公司；甲酸（＞98.0%）购于日本TIC公司。

1.2 茶叶感官审评方法

参照GB/T 22111—2008中普洱茶（生茶）审评方法，对茶样的外形、内质各项审评因子进行评价，但不打分。

表1 不同茶山（自然村）普洱生茶样品基本信息Table 1 Information of Pu-erh raw tea samples from 12 areas

1.3 样品制备

采用多功能高速粉碎机（IKA，德国）对上述茶样进行粉碎（约100目）。称取每个茶叶样品 0.3 g于 50 mL离心管中，以 45 mL 100℃沸水浸提5 min，每隔1 min对离心管进行上下摇晃，然后高速离心机离心10 min，转速为 8 000 r·min-1，取 2 mL 上清液过 0.22 μm滤膜后进行基于UHPLC-Q-TOF/MS的代谢组学分析。每个样品重复提取3次，均进行代谢组学分析。

1.4 UHPLC-Q-TOF/MS分析

采用超高效液相色谱（UHPLC Infinity 1290，安捷伦公司，美国）串联四级杆飞行时间质谱进行测定（Q-TOF 6540，安捷伦公司，美国），色谱质谱条件主要参数如下。

色谱条件：色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，安捷伦公司，美国），流动相A相为0.1%甲酸-水，B相为甲醇；进样量为3 μL；流速为0.4 mL·min-1；柱温为40℃；流动相线性梯度洗脱为：0 min，10%B相；4 min，15%B相；7 min，25%B 相；9 min，32%B 相；16 min，40%B相；22 min，55%B 相；28 min，95%B；30 min，95%B；柱后平衡时间为5 min。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI）；扫描方式为正离子模式；毛细管电压为 3 500 V；干燥气温度和流速分别为300℃和8 L·min-1；雾化气压强为35 psi；鞘气温度和流速分别为300℃和 11 L·min-1；质谱扫描范围，质荷比(m/z)为 100～1 000。

1.5 实验数据处理与分析

UHPLC-Q-TOF/MS分析获得的原始谱图采用 Profinder B.08.00软件和 Mass Profiler Professional 13.0软件（安捷伦公司，美国）进行峰匹配和积分。主成分分析采用Simca-P 11.5软件（Umetrics公司，瑞典）。热图分析由MultiExperiment Viewer软件完成。差异显著性分析采用 Student’st-test。

2 结果与分析

2.1 普洱生茶样品的感官审评结果

12个茶山（自然村）普洱生茶感官审评结果见表2。总体上，该批普洱生茶样品外形色泽呈墨绿或灰绿油润有光泽，条索紧实、显毫；内质上，香气馥郁，多清香、花香，滋味醇厚回甘，汤色黄绿、明亮，叶底柔嫩。具体以滋味品质结果分析，不同产地的普洱生茶滋味品质特点表现有所差异，其中产自临沧产区的昔归和冰岛滋味上呈现甜醇饱满、回甘持久的特点；普洱产区的景迈滋味甜醇、稍涩；西双版纳州产区中勐海县的老班章、勐宋和南糯滋味表现为醇厚回甘、略苦；景洪市的攸乐滋味醇厚、略涩；勐腊县的莽枝、革登、蛮砖、曼撒、倚邦滋味上具有醇和饱满，甜醇协调的特点。

图1 普洱生茶LC-MS分析总离子色谱图（以老班章为例）Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of the pu-erh raw tea by LC-MS (the Laobanzhang was used as an example)

2.2 12个茶山（自然村）普洱生茶中的主要成分及其含量分布

普洱生茶LC-MS代谢组学分析的典型色谱图如图1所示，经峰提取和峰匹配后，共得到3 104个化合物特征离子。根据课题组在绿茶、红茶和普洱茶代谢组学分析和化合物结构鉴定方面的前期工作[24-26]，结构鉴定了普洱生茶中79个主要成分，其中氨基酸类13个、儿茶素类11个、茶黄素类3个、聚酯型儿茶素3个、原花青素5个、生物碱类4个、黄酮糖苷类19个、酚酸类12个、核苷类5个、香气糖苷前体化合物4个（图2）。

图2 12个茶山（自然村）普洱生茶主要成分热图分析Fig. 2 Heat-map of metabolite contents in pu-erh raw teas from 12 tea mountains

在 12个茶山（自然村）普洱生茶中，79个主要成分的含量分布如图2所示，横向代表茶样，纵向代表化合物，红色代表化合物在茶样中含量高于平均值，绿色代表化合物在茶样中含量低于平均值，颜色深浅代表含量高低程度。总体而言，儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）这3种儿茶素在冰岛、昔归、勐宋、蛮砖等普洱生茶中含量显著高于革登、倚邦、攸乐、老班章等普洱生茶中的含量（P=0.025）。没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）这4种儿茶素在曼撒、蛮砖、倚邦、攸乐等普洱生茶中含量显著高于冰岛、南糯、革登、老班章、景迈等普洱生茶中的含量（P=0.028）。咖啡碱在老班章、勐宋、南糯等普洱生茶中含量最高。莽枝、倚邦、蛮砖等普洱生茶中的游离氨基酸含量高于南糯和曼撒中游离氨基酸含量，革登具有较高含量的茶氨酸、异亮氨酸和酪氨酸，但其他种类的氨基酸含量较低。茶黄素和聚酯型儿茶素等二聚儿茶素在革登、莽枝、曼撒、蛮砖、倚邦、攸乐等普洱生茶中含量最高，且是其他普洱生茶含量的2倍（P=0.007）。黄酮-C-糖苷在景迈、南糯、昔归、莽枝、曼撒、蛮砖等普洱生茶中含量是老班章、攸乐、倚邦、革登等普洱生茶中含量的1.5倍（P=0.005）。黄酮-O-糖苷类化合物主要包括山柰酚糖苷和槲皮素糖苷，其中槲皮素糖苷在景迈和勐宋普洱生茶中含量最高。没食子酰基化葡萄糖类化合物（如没食子酰葡萄糖、双没食子酰葡萄糖、三没食子酰葡萄糖、小木麻黃素等）在冰岛、老班章、勐宋、攸乐等普洱生茶中显著高于景迈、昔归、莽枝、曼撒、倚邦等普洱生茶中含量（P=0.002）。香气糖苷前体物质在老班章和攸乐等普洱生茶中含量最高。

2.3 不同产地普洱生茶代谢组表型主成分分析

以3 104个化合物特征离子进行主成分分析（PCA），不同产地普洱生茶代谢组表型见图 3，距离远近代表茶样代谢组表型差异大小。其中，倚邦、莽枝、曼撒、蛮砖4个茶山（自然村）的茶样在主成分得分图上最为靠近，代表化学成分上最为接近。冰岛、攸乐、昔归、南糯、老班章这5个茶山（自然村）的茶样与其他茶样距离较远，代表在化学成分上与其他茶样的差异较大。

图3 12个茶山（自然村）普洱生茶主成分分析得分图（R2X=0.694）Fig. 3 PCA score plot of pu-erh raw teas from 12 tea mountains (R2X=0.694)

图4 12个茶山（自然村）普洱生茶主成分分析得分图（产地）Fig. 4 PCA score plot of pu-erh raw teas from 12 mountains (area)

图5 12个茶山（自然村）普洱生茶主成分分析得分图（地理位置）Fig. 5 PCA score plot of pu-erh raw teas from 12 mountains (geographic location)

结合12个茶山（自然村）的产地分布情况，发现12个茶山（自然村）的普洱生茶的化学成分具有明显的产地特征。如图4所示，来自西双版纳自治州的勐腊、勐海、景洪的茶样主要分布于得分图上方和左方，而普洱市和临沧市的茶样主要分布于得分图右下方。其中来自勐腊县的倚邦、莽枝、曼撒、蛮砖、革登5个产地的茶样在主成分得分图上紧密地聚集在同一区域，来自勐海县的老班章、勐宋、南糯 3个产地的茶样分布在主成分得分图右上区域。冰岛普洱生茶和昔归普洱生茶同样产自临沧市，但两者在得分图上相距相对较远，可能是由于两者产地海拔相差较大的原因（冰岛普洱生茶产地海拔 1 500～1 850 m，昔归普洱生茶产地海拔约750 m）。表明采用代谢组表型可以作为普洱生茶产地判别的依据。

根据《中国国家地理》关于澜沧江流域普洱茶产区分布，结合云南普洱产区地理位置及气候环境，以北回归线与澜沧江交汇点为中心点，可以将云南普洱茶生产地划分为东北、东南、西北、西南 4个区域[27]。位于澜沧江东岸的东北茶区具有高海拔、高纬度的自然环境特点，东南茶区纬度低、地势平缓，受热带及亚热带季风气候影响。而位于澜沧江西岸的西北茶区纬度高、地势险峻，西南茶区纬度低，受南亚热带季风影响，气候温润潮湿。上述12个产地普洱生茶代谢组表型也表现出较强的区域特征（图5）。东南区域的倚邦、莽枝、曼撒、蛮砖、革登、攸乐茶山分布于图 5左侧。由于这六大茶山是山脉相连，西面是攸乐茶山，中间是革登、莽枝、倚邦、蛮砖茶山，东面是曼撒茶山，在地理位置和生态环境方面都具有一定的相似性，故而其茶叶品质上也具有共性，在图中呈现在同一区域。西南区域的老班章、南糯、勐宋、景迈茶山分布于图 5右侧，而在地理位置上澜沧县的景迈山与勐海县相邻，地处澜沧江的中下游，纬度较低，受热带及亚热带季风气候影响，光照充足，雨量丰沛。西北区域的冰岛和昔归茶山分布于图5下方。

2.4 化学成分与普洱生茶滋味区域特征关系

图6 12个茶山（自然村）普洱生茶主要成分的主成分分析结果Fig. 6 PCA results of main compounds in Pu-erh raw teas from 12 tea mountains

茶叶滋味的化学组成较为复杂，呈味物质的种类、含量及其比例变化均可使茶汤滋味品质发生改变。目前研究发现的茶汤中的呈味成分及其呈味特性主要有：茶汤中酯型儿茶素与非酯型儿茶素的含量和比例是影响茶汤苦涩味的重要因素，酯型儿茶素苦涩味及收敛性较强，而非酯型儿茶素涩味及收敛性较弱，且回味爽口[28]；生物碱类，尤其是咖啡碱是茶汤苦味的重要来源；茶氨酸、谷氨酸及天冬氨酸等氨基酸是茶汤中主要的鲜味物质。同时，近年来也有研究表明[29-30]，黄酮糖苷类物质不仅是茶汤的重要呈色物质，而且也是茶汤中的呈味物质，具有一种引起口腔干燥和柔软收敛性的涩味。为进一步研究12个茶山（自然村）普洱生茶区域滋味特征与化学成分的关系，以结构鉴定的79个主要成分进行PCA分析（图6）。图6-A为PCA得分图，代表样本的分布，图6-B为 PCA载荷图，代表化合物的分布，R2X=0.872。与样本位于同一象限的化合物代表该化合物在样本中含量较高，与样本位于相反象限的化合物代表该化合物在样本中含量较低。如图6所示，在化学成分上，临沧市产地的普洱生茶（冰岛、昔归），其 C、EC、ECG、山柰酚-3-葡萄糖苷、山柰酚-3-葡萄糖酰芸香糖苷、芦丁、黄酮-C-糖苷、天冬氨酸、天冬酰胺、腺甘酸、原花青素等成分的含量较高，而EGCG、GCG、甲基化EGCG、EGC、聚酯型儿茶素含量较低。在滋味感官品质上，临沧产区普洱生茶表现为甜醇饱满且回甘持久的特点。景洪市的攸乐普洱生茶在化学成分上与临沧市普洱生茶（冰岛、昔归）相反，其滋味感官品质上表现为“醇厚、略涩”的特点。勐海县产地的普洱生茶（老班章、勐宋、南糯）在化学成分上，酚酸类（尤其是没食子酰基化葡萄糖类，如没食子酰葡萄糖、双没食子酰葡萄糖、三没食子酰葡萄糖、小木麻黃素）和芳樟醇樱草糖苷含量较高；相对地，氨基酸类（苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸）、山柰酚-3-半乳糖苷、茶黄素、黄酮-C-糖苷、聚酯型儿茶素、苯乙醇樱草糖苷含量较低。在滋味感官品质上，勐海县普洱生茶具有醇厚回甘、略苦的特点；而勐腊县产地的普洱生茶（倚邦、莽枝、曼撒、革登、蛮砖）的化学成分与之相反，滋味上具有醇和饱满、甜醇协调的特点。

3 讨论

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS对来自临沧市、普洱市、西双版纳州三大产区12个茶山（自然村）的普洱生茶的非挥发性代谢物表型进行了研究，结果发现不同产地普洱生茶其化学成分含量具有较大差异，化学成分含量分布上具有明显的产地特征。本研究鉴定了普洱生茶中79种主要成分，其中氨基酸类13个，儿茶素类11个，茶黄素类3个，聚酯型儿茶素3个，原花青素5个，生物碱类4个，黄酮糖苷类19个，酚酸类12个，核苷类5个，香气糖苷前体化合物 4个。对普洱生茶 LC-MS分析的结果进行PCA分析，不同产区的普洱生茶可以被有效地区分，表明采用代谢组表型结合PCA分析可以作为普洱生茶产地判别的依据。

已有研究表明，普洱茶的茶区与品质具有较大相关性，如梁名志等[31]研究发现不同产地（勐海县、勐腊县、澜沧县）晒青茶品质风格各异，南糯茶山的茶味较浓强、易武的鲜活度高，景迈的醇厚度好，与本研究结果一致。结合本研究中茶叶化合物在不同产地的含量分布情况和感官审评结果，推测临沧产区普洱生茶滋味品质“甜醇饱满、回甘持久”可能主要是由于天冬氨酸、天冬酰胺、腺甘酸等呈鲜爽味的化合物含量高，而呈涩味具有较强收敛性的酯型儿茶素如EGCG、GCG等含量低（图6）。普洱产区的景迈普洱生茶滋味“甜醇、稍涩”，其“稍涩”的原因可能是呈涩味的黄酮-C-糖苷类化合物含量较高（图6）。西双版纳州产区的勐海产地普洱生茶具有“醇厚回甘、略苦”的特点，可能是因为滋味成分上没食子酰基化葡萄糖类（如没食子酰葡萄糖、双没食子酰葡萄糖等）和呈苦味的生物碱（如咖啡碱、可可碱）等化合物含量较高。勐腊产地普洱生茶滋味“醇和饱满、甜醇协调”可能是因为氨基酸类（苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸）、茶黄素、聚酯型儿茶素含量较高。

不同产地普洱生茶感官品质与化学成分差异受茶树品种、生长环境、加工工艺、储藏条件等因素综合影响，今后还需扩大不同产地、不同季节、不同生产厂家、不同储藏时间的普洱生茶样本量，对发现的差异关键化合物进行进一步筛选并建立判别模型，为普洱生茶产地判别提供依据。

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Study on the Chemical Constituents of Pu-erh Teas from Different Areas by UHPLC-Q-TOF/MS

YANG Chen1,2, DAI Weidong1*, LYU Meiling3, LI Pengliang1,2, LIU Xu1,TIAN Jun4, WAN Yunlong4, LI Ji4, LIN Zhi1*

1. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3. Agilent Technologies (China) Co., Ltd., Beijing 100102, China;4. Kunming Colourful Yunnan King-Shine Tea Industry Co., Ltd, Kunming 650501, China

In order to fully understand the influences of the production area on pu-erh raw tea quality and chemical composition, 12 pu-erh raw tea samples were selected from different mountains (villages) in Lincang, Pu'er, and Xishuangbanna. The nonvolatile tea metabolite phenotypes of the pu-erh raw teas were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry-four (UHPLC-Q-TOF/MS). The results showed that the pu-erh raw teas from different areas had distinct chemical compositions. Pu-erh raw teas from Xishuangbanna (including Mengla, Menghai, and Jinghong), Pu'er, and Lincang could be seperated by principal component analysis. Pu-erh raw teas could also be seperated according to producing areas (southeast, southwest, and northwest of pu-erh tea area). Seventy nine main components in pu-erh raw teas were identified, and the relationships between the components and the taste qualities of the 12 pu-erh raw teas were also analyzed. This study showed that the metabolite phenotypes analyzed by UHPLC-Q-TOF/MS could be used for the discrimination of pu-erh raw teas according to producing areas.

Pu-erh raw tea, area, chemical composition, LC-MS, metabolomics, taste

TS272.5+4；O657.63

A

1000-369X（2017）06-605-11

2017-04-05

2017-08-15

国家自然科学基金（31500561）、中央级公益性科研院所所级基本科研业务费专项（1610212016008）、现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-23）

杨晨，女，硕士研究生，主要从事茶叶加工品质化学研究，E-mail: yangchen@tricaas.com。*通讯作者