黄芥籽多糖超声辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

赵 强，尹爱萍，贾 楠，赵二劳

(忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000)

黄芥籽多糖超声辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

赵 强，尹爱萍，贾 楠，赵二劳

(忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000)

以多糖提取率为指标，在单因素试验的基础上，利用响应面试验优化黄芥籽多糖的超声辅助提取工艺，并采用DPPH·和·OH清除法评价其抗氧化活性。结果表明，黄芥籽多糖超声辅助提取最佳工艺条件为：提取温度51℃，提取时间25 min，超声功率280 W，料液比1∶40。在最佳工艺条件下，黄芥籽多糖提取率为14.18%。黄芥籽多糖与BHT对DPPH·的半清除率(IC50)分别为0.177 mg/mL和0.107 mg/mL，对·OH的IC50分别为0.24 mg/mL和0.22 mg/mL，表明黄芥籽多糖具有较强的抗氧化活性。

黄芥籽粕；多糖；超声辅助提取；抗氧化活性；响应面法

黄芥(BrassicajunceaL.)为十字花科芸薹属植物，是一种芥菜型油菜[1]，主要分布于山西、陕西、河北、内蒙、甘肃以及青海等相邻的黄土高原，资源丰富。黄芥籽不仅含油高，且含有蛋白质、多糖及多酚等营养成分[2-3]。

目前，黄芥籽主要用作榨油，榨油后的副产品黄芥籽饼粕除少量用作饲料外，大多作农肥使用，产品附加值不高，其所含的蛋白质、多糖及多酚等营养活性成分未能有效利用，造成极大的资源浪费。研究表明[4-5]，菜籽多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖和调节免疫功能等多种生理活性，是一种具有较高开发价值的多糖。但目前有关黄芥籽多糖的研究鲜有报道，同时，基于超声辅助提取技术在天然产物活性成分提取中具有简单易行、时间短、效率高和适用性广等优点[6-8]，本研究以黄芥籽粕为原料，利用超声辅助提取黄芥籽多糖，通过单因素试验结合响应面试验优化黄芥籽多糖的提取工艺条件，并采用1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)和羟自由基(·OH)清除法评价其抗氧化活性[9]，为黄芥籽粕的深度开发及其多糖的提取提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

黄芥籽粕：购于当地榨油厂，粉碎，过40目筛，在石油醚中浸泡过夜脱脂，除去溶剂，再加入95%乙醇浸泡过夜，除去单糖、低聚糖及其他醇溶性杂质，真空泵抽滤，滤渣50℃烘干，备用。

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，美国Sigma公司；葡萄糖、无水乙醇、硫酸、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平，SP-732型分光光度计，KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵。

1.2 试验方法

1.2.1 黄芥籽多糖的提取

工艺流程：经预处理黄芥籽粕粉→加水→超声辅助提取→过滤、提取液浓缩→醇沉→离心→沉淀洗涤→干燥→粗多糖。

主要工艺参数：预处理黄芥籽粕粉1.0 g，提取液浓缩后加4倍体积的无水乙醇，4℃过夜醇沉，4 000 r/min离心20 min取沉淀，无水乙醇洗涤2次，45℃恒温干燥，其余工艺条件按试验设计要求。

1.2.2 黄芥籽多糖提取率的测定

1.2.2.1 标准曲线绘制

以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法[2]绘制标准曲线。测定系列葡萄糖对照品溶液在490 nm波长处的吸光度，以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得葡萄糖质量浓度在0.02～0.20 mg/mL的范围内，与吸光度呈线性关系，回归方程为：A=1.040 4ρ+0.024，R2=0.999 4。

1.2.2.2 多糖含量及提取率的测定

取黄芥籽多糖提取液适量，按1.2.2.1中葡萄糖对照品方法测定其吸光度，由标准曲线方程计算多糖含量。黄芥籽多糖提取率=多糖质量/黄芥籽粕质量×100%。

1.2.3 黄芥籽多糖抗氧化活性的测定

1.2.3.1 黄芥籽多糖对DPPH·清除率的测定

[9]的方法略加改动。准确量取2.0 mL 0.1 mg/mL的DPPH溶液于10 mL比色管中，再加入一定量的黄芥籽多糖溶液，用水定容至刻度，摇匀，室温下避光反应30 min后，在517 nm波长处测定其吸光度。按下式计算DPPH·清除率，计算其半清除率(IC50)，IC50值愈小，抗氧化剂的抗氧化活性愈强。

DPPH·清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0为仅DPPH溶液体系的吸光度；Ai为DPPH溶液中加入黄芥籽多糖溶液后体系的吸光度；Aj为仅黄芥籽多糖溶液体系的吸光度。

同法测定BHT对DPPH·的清除率，计算其IC50。

1.2.3.2 黄芥籽多糖对·OH清除率的测定

参考文献[10]的方法稍作修改。在10 mL比色管中，依次加入7.50×10-3mol/L硫酸亚铁溶液、0.1%的H2O2溶液和7.50×10-3mol/L的水杨酸溶液各1.0 mL，再加入一定量的黄芥籽多糖溶液，用水定容至刻度，摇匀，置于37℃恒温水浴中反应40 min后，于510 nm处测定其吸光度。按下式计算·OH清除率，计算其IC50。

·OH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

在小学体育学科教学中教师必须考虑到小学生的身心发展特点，从而制定出小学生喜闻乐见的教学方式方法。为此，在小学体育学科教学的实践创新上应当尽量采用游戏、比赛、情景等教学方法，激发学生的运动兴趣，让学生体验到运动所带来的愉悦感，从而产生强大、持久的内驱力，培养学生的终身体育意识。由于小学生的年龄特点，兴奋占优势，兴奋抑制转换快，好奇心重，上进心强，故适度变换教学手段会取得比较好的效果，这也是未来小学体育学科教学中实施实践创新的突破口。

式中：A0为空白对照体系的吸光度(不加黄芥籽多糖)；Ai为加入黄芥籽多糖溶液后体系的吸光度；Aj为仅黄芥籽多糖溶液体系的吸光度。

同法测定BHT对·OH的清除率，计算其IC50。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对黄芥籽多糖提取率的影响

准确称取经预处理的黄芥籽粕粉1.0 g，在料液比1∶40、超声功率320 W、提取时间25 min的条件下，考察提取温度对黄芥籽多糖提取率的影响，结果见图1。

图1 提取温度对多糖提取率的影响

由图1可知，黄芥籽多糖的提取率随提取温度的升高，呈现先增大后减小的趋势，在50℃时出现最大值。其原因可能是温度升高，分子运动加快，有利于溶剂的渗透和多糖分子的扩散，多糖更容易被提取出来，使多糖提取率增大；但温度过高时，会破坏多糖的结构，使多糖降解，导致多糖提取率有所下降[11-12]。因此，选择提取温度为50℃。

2.1.2 提取时间对黄芥籽多糖提取率的影响

准确称取经预处理的黄芥籽粕粉1.0 g，在料液比1∶40、超声功率320 W、提取温度50℃的条件下，考察提取时间对黄芥籽多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对多糖提取率的影响

2.1.3 超声功率对黄芥籽多糖提取率的影响

准确称取经预处理的黄芥籽粕粉1.0 g，在料液比1∶40、提取时间25 min、提取温度50℃的条件下，考察超声功率对黄芥籽多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 超声功率对多糖提取率的影响

由图3可知，当超声功率小于280 W时，随超声功率的增大，黄芥籽多糖提取率逐渐增大，当超声功率大于280 W时，随超声功率增大，多糖提取率有所降低。原因可能是在一定的超声功率范围内，随超声功率增大，空化作用增加，其对细胞壁的破碎作用增强，多糖溶出快，提取率就增大；但超声波强度过大，会导致空气气泡没有足够时间溃陷，空化作用降低，导致多糖提取率下降[11]。因此，选择超声功率为280 W。

2.1.4 料液比对黄芥籽多糖提取率的影响

准确称取经预处理的黄芥籽粕粉1.0 g，在超声功率320 W、提取时间25 min、提取温度50℃的条件下，考察料液比对黄芥籽多糖提取率的影响，结果见图4。

图4 料液比对多糖提取率的影响

由图4可知，随着料液比的增大，黄芥籽多糖提取率呈先增大后减少的趋势，在料液比为1∶40时，多糖提取率达到最大。原因可能是料液比较小时，体系流动性差，影响多糖的溶出，提取率低。料液比增加，溶剂与浸提物接触越充分，更有利于多糖的溶出，多糖提取率增加。但料液比过大时，超声波辐射被溶剂大量吸收，不能完全作用于黄芥籽粕，影响多糖溶出，导致多糖提取率有所下降[14]。因此，选择料液比为1∶40。

2.2 响应面试验

在单因素试验的基础上，按Box-Behnken中心组合试验设计原理，以黄芥籽多糖提取率(Y)为响应值，提取温度(X1)、提取时间(X2)、超声功率(X3)和料液比(X4)为因素，进行四因素三水平的响应面优化试验。因素与水平见表1，响应面试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

续表2

试验号 X1 X2 X3 X4Y/%4110013．21500-1-19．656001-111．92700-1111．878001113．439-100-110．5510100-112．9411-100112．8612100113．78130-1-108．871401-1011．19150-1109．8216011013．1817-10-109．121810-1012．0819-101012．1320101013．64210-10-18．9822010-112．54230-10110．1524010113．0825000013．8626000014．2227000014．1628000013．8729000013．93

表3 方差分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中试验数据进行响应面多元回归分析，得到拟合的二次多元回归方程为：

由表3可知，该模型Plt;0.000 1，表明模型具有极高的显著性，而失拟项Pgt;0.05不显著，说明建模成功，试验设计结果可靠。同时，回归方程相关系数R2=0.979 4，表示模型的响应值变化97.94%来自所选考察变量，表明拟合的回归方程可以很好地描述考察因素与响应值间的关系，因此，可以用该模型对超声辅助提取黄芥籽多糖的工艺条件和提取率进行分析和预测[15-16]。由表3还可知，X1、X2、X3和X4的一次项、二次项对响应值的影响都达到极显著水平，这表明各个试验因素对黄芥籽多糖提取率的影响不是简单的线性关系。4个因素对黄芥籽多糖提取率影响大小顺序为：X2gt;X1gt;X3gt;X4，即提取时间gt;提取温度gt;超声功率gt;料液比。

对二次回归方程中X1、X2、X3和X44个因素分别求偏导，并令等式为零，解方程求得4个因素的最佳水平值分别为：X1=0.77、X2=0.38、X3=0.02、X4=-0.36。即超声辅助提取黄芥籽多糖的最佳工艺条件为提取温度50.77℃、提取时间 25.19 min、超声功率280.08 W、料液比1∶39.64，在此工艺条件下，黄芥籽多糖提取率的理论预测值为14.27%。

2.3 验证试验

考虑实际操作的局限性，将工艺条件调整为提取温度51℃、提取时间25 min、超声功率280 W、料液比1∶40，进行5次重复试验，得到黄芥籽多糖的提取率分别为14.26%、14.16%、14.18%、14.24%、14.08%，平均值为14.18%，相对标准偏差(RSD)为0.50%，与理论预测值的相对误差为0.63%。表明响应面分析的优化结果与试验值相吻合，进一步验证了该模型的可行性，具有一定的实用价值。

2.4 黄芥籽多糖的抗氧化活性

2.4.1 黄芥籽多糖对DPPH·的清除率(见图5)

由图5可知，黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对DPPH·的清除率随其质量浓度的增加而增大，呈较好的量效关系。黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对DPPH·的IC50分别为0.177 mg/mL和0.107 mg/mL。表明黄芥籽多糖对DPPH·的清除能力稍弱于常用抗氧化剂BHT。事实上，虽然黄芥籽多糖对DPPH·的清除能力弱于BHT，但也不可忽视黄芥籽多糖对DPPH·的清除能力，且较化学合成抗氧化剂而言，以天然产物作为抗氧化剂具有一定的安全性。因此，黄芥籽多糖可作为一种新型天然抗氧化剂使用。

图5 黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对DPPH·的清除率

2.4.2 黄芥籽多糖对·OH的清除率(见图6)

图6 黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对·OH的清除率

由图6可知，黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对·OH 的清除率随其质量浓度的增加而增大，呈明显的量效关系。黄芥籽多糖溶液与BHT溶液对·OH的IC50分别为0.24 mg/mL和0.22 mg/mL。表明黄芥籽多糖溶液对·OH的清除能力稍弱于常用抗氧化剂BHT，但也具有较强的·OH清除能力。

3 结 论

采用单因素试验与响应面试验相结合的方法，对黄芥籽多糖的超声辅助提取工艺条件进行了优化，得到黄芥籽多糖超声辅助提取的最佳工艺条件为：提取温度51℃，提取时间25 min，超声功率280 W，料液比1∶40。在最佳工艺条件下，黄芥籽多糖提取率为14.18%。抗氧化活性研究表明，在试验条件下，黄芥籽多糖具有较强的抗氧化活性，其对DPPH·和·OH的清除能力随其质量浓度的增加而增强。黄芥籽粕是一种具有开发潜力的天然抗氧化剂新资源。

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Ultrasound-assistedextractionofpolysaccharidesfromBrassicajunceaL.seedmealanditsantioxidantactivity

ZHAO Qiang,YIN Aiping, JIA Nan, ZHAO Erlao

(Department of Chemistry, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000,Shanxi, China)

The ultrasound-assisted extraction of polysaccharides fromBrassicajunceaL. seed meal was optimized with extraction rate as index by response surface methodology based on single factor experiment. The antioxidant activities of the extracted polysaccharides were measured by scavenging DPPH· and ·OH. The results showed that the optimal extraction conditions were obtained as follows: extraction temperature 51℃, extraction time 25 min, ultrasonic power 280 W, ratio of solid to liquid 1∶40. Under these conditions, the extraction rate of polysaccharides was 14.18%. The half-scavenging rates (IC50) on DPPH· of the extracted polysaccharides and BHT were 0.177 mg/mL and 0.107 mg/mL, respectively. TheIC50on ·OH of the extracted polysaccharides and BHT were 0.24 mg/mL and 0.22 mg/mL, respectively. The polysaccharides fromBrassicajunceaL. seed meal exhibited powerful antioxidant activity.

BrassicajunceaL. seed meal; polysaccharides; ultrasound-assisted extraction; antioxidant activity; response surface methodology

TS229； TS209

A

1003-7969(2017)11-0124-05

2017-03-11；

2017-07-25

国家级大学生创新创业训练计划项目(201610124001)；山西省高等学校大学生创新创业训练计划项目(2016381)；忻州师范学院重点学科项目(XK201502)；忻州师范学院化学化工创新基地项目(2017)

赵 强(1981)，男，助理实验师，主要从事天然产物活性成分分析(E-mail) 304814067@qq.com。

赵二劳，教授 (E-mail) zel0350@163.com。