解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌的构建及挥发性脂肪酸的利用

倪丽娟，张白曦，陈 卫，张 灏

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

生物工程

解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌的构建及挥发性脂肪酸的利用

倪丽娟，张白曦，陈 卫，张 灏

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

为了抑制解脂耶氏酵母长链脂肪酸的β氧化，使其稳定地积累，通过基因调控途径构建了4株脂肪酸β氧化基因敲除菌株，并研究了重组菌株利用挥发性脂肪酸作为碳源合成长链脂肪酸的能力。结果表明：分别敲除pox2、pox3和pex10的3株单基因敲除菌株及同时敲除pox2和pox3的组合基因敲除菌株构建成功，4株重组菌株均可以利用挥发性脂肪酸进行生长。与原始菌株相比，polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10总脂产量(长链脂肪酸总和)在发酵后期并未因脂肪酸的β氧化而出现明显下降，是可以利用挥发性脂肪酸且可实现脂质积累的重组菌株。

解脂耶氏酵母；β氧化；长链脂肪酸；挥发性脂肪酸

由于解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)具有生物合成相关的生理生化特性及成熟的分子操作系统，目前已开发用作有机酸、蛋白酶以及单一脂质的生产菌[1]。作为一种典型的产油真菌，解脂耶氏酵母能够积累大量的脂质，主要以甘油三酯(TAG)和甾醇酯(SE)等中性脂的形式储存在脂质体中[2]。因此，解脂耶氏酵母的潜在应用是合成具有生理活性功能的长链多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、EPA、DHA等[3]。目前，解脂耶氏酵母积累的脂质占细胞干重的38%[4]，且脂质会被降解利用，为了进一步提高其稳定积累脂质尤其是长链脂肪酸的能力，本实验通过基因调控手段构建了4株切断脂肪酸β氧化途径的菌株，分别为polf-Δpox2、polf-Δpox3、polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10菌株，其中pox基因是催化脂肪酸β氧化第一步限速步骤的6种酰基辅酶A的基因，pox2和pox3基因编码的酰基辅酶A对长链脂肪酸具有底物特异性[5-6]，Δpox2和Δpox3可以抑制菌株对长链脂肪酸的降解作用；而pex10基因编码蛋白参与过氧化物酶体基质蛋白的运输[7-9], 敲除pex10会导致过氧化物酶体变形受损，切断脂肪酸的β氧化，从而积累更多的脂肪酸[10]。

解脂耶氏酵母可以利用正烷烃、脂肪酸和脂肪等多种形式的碳源进行生长。为了降低实验产脂成本，本实验采用廉价的挥发性脂肪酸(VFAs)作为唯一碳源对菌株进行初步培养，比较不同重组菌株利用VFAs的差异性，实验还测定了菌株的生物量和总脂产量(长链脂肪酸总和)，以亟选出可利用廉价碳源且积累脂质的目标菌株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

大肠杆菌(DH5α)由江南大学食品生物技术中心菌种库提供；质粒pBluescriptⅡKS+(DH5α)购自NEB公司；质粒pINA1296(DH5α)[11]、pUB4-Cre (DH5α)[12]以及解脂耶氏酵母(polf)[13]由Catherine Madzak教授(法国)惠赠。

1.1.2 主要试剂

Taq酶、T4连接酶以及所需限制性内切酶均购自Takara公司； pfu酶、无缝克隆试剂盒均购自北京全式金；脂肪酸标准品以及酵母转化试剂(PEG4000、DTT、DMSO、Trizma、EDTA等)购自Sigma公司；氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素B均购自上海生工。ura minus培养基、leu minus培养基购自北京泛基诺。

1.1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，需要时添加琼脂粉20 g/L、卡那霉素50 mg/L、氨苄青霉素100 mg/L，以筛选带有抗性的转化子。

YPD培养基：葡萄糖 0 g/L，酵母提取物 10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 6.5，需要时添加琼脂粉20 g/L。

YNB-leu培养基：leu minus 培养基 8 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0～6.5，需要时添加琼脂粉20 g/L。

YPG培养基：D-L半乳糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L,需要时添加琼脂粉20 g/L，潮霉素B用于转化子筛选。

YNBD培养基：葡萄糖20 g/L，酵母氮基(无氨基酸、无(NH4)2SO4)1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 5.5，需要时添加琼脂粉 20 g/L，用于转化子筛选。

YPO液体培养基：酵母提取物 10 g/L，胰蛋白胨 20 g/L，油酸10 g/L，pH 6.5。

YPV液体培养基：VFAs(乙酸、丙酸与丁酸质量比为6∶1∶3[14])5.0 g/L，代替YPD中的葡萄糖，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 6.5。

1.1.4 实验仪器

GS00001型PCR仪(G-STROM公司)；Power PAC核酸电泳仪(Bio-Rad公司)；Geldoc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；NanoDrop2000分光光度计(Thermo公司)；GC-2010气相色谱仪(岛津公司)；气质联用仪(Varian公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 敲除质粒的构建

参照Fickers等[12]方法，具体如下：

(1)构建ML组件，以质粒pINA1296(DH5α)为模板扩增leu2标记基因，并连接在LPR组件(金斯瑞公司合成)loxR和loxP之间。构建后的质粒转化到DH5α感受态细胞并涂布于含氨苄青霉素的 LB平板，挑选转化子，酶切及PCR验证正确后测序。

(2)构建侧翼片段启动子-终止子组件，以polf为模板，分别扩增目标基因pex10上下游片段P和T，并连接到载体pBluescriptⅡKS+(DH5α) 上，将构建后的质粒转化并挑选单克隆，PCR以及测序验证，得到重组载体PT-pex10。同理构建PT-pox2，PT-pox3。

(3)构建PLT组件，利用内切酶I-SceI分别酶切质粒ML、PT-pex10，T4连接酶将产物连接，构建后的质粒转化并进行筛选鉴定，得到载体PLT-pex10。同理构建PLT-pox2，PLT-pox3。

1.2.2 敲除菌株的构建

参照Fickers等[12]方法，具体如下：

(1)单基因敲除菌株的构建：PCR扩增PLT敲除组件醋酸锂转化法转化至出发菌株polf, 涂布于选择性平板YNB-leu，3组PCR及测序验证正确重组子，得到重组菌株polf-Δpex10、polf-Δpox2、polf-Δpox3。

(2)双基因敲除菌株的构建：以polf-Δpox2为出发菌株, 转化质粒PUB4-Cre，在YPG 培养基中半乳糖诱导表达Cre酶切除leu2基因，验证切除正确后，在YPD培养基中连续传代丢失质粒PUB4-Cre, 再转入敲除pox3基因的PLT-pox3组件，在YNBD培养基中筛选，PCR验证及测序正确，得到重组菌株polf-Δpox2Δpox3。

1.2.3 生长曲线测定

不同发酵时间点取样，以空白培养基为对照，利用分光光度计测定发酵液在600 nm处的吸光度，以发酵时间为x轴，OD600为y轴绘制菌株生长曲线。

1.2.4 培养基中残留VFAs的测定及分析

采用乙醚衍生化方法预处理并利用气质联用仪测定，具体参考贾益群等[15]的方法。

1.2.5 菌体生物量的测定

全发酵液8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用0.85%的NaCl溶液洗涤菌体2次，冷冻干燥，称量干菌重，减去胞内脂质总量，即为生物量。

1.2.6 菌体脂质提取及分析

菌体脂肪酸含量的测定参照文献[16]，实验所提到的总脂(TFA)为长链脂肪酸总和。

2 结果与分析

2.1 基因敲除质粒的验证

本实验使用Cre-lox方法可以定向切除营养标记，以保证标记基因可以重复利用[12]。酶切验证见图1。

注：M.Marker；A(PLT-pex10).1为敲除质粒，2为SphI和 NotI双酶切后片段；B(PLT-pox2).1为敲除质粒，2为EcoRI单酶切后片段；C(PLT-pox3).1为敲除质粒，2为ApaI单酶切后片段。

图1敲除质粒酶切验证结果

由图1可知，理论序列长度与实验凝胶电泳结果一致，且测序结果与理论值相同，证明敲除质粒PLT-pex10、PLT-pox2、PLT-pox3构建成功。

2.2 单基因敲除菌株的验证

PLT敲除组件利用leu2作为标记基因通过同源重组分别删除1 100 bp pex10 ORF、2.1kb pox2 ORF、1 100 bp pox3 ORF序列，得到polf-Δpex10、polf-Δpox2、 polf-Δpox3重组菌株。重组菌株一般培养2 d即形成菌落，转化率1 200～1 500个/μg。实验设计了3对引物以充分排除假阳性菌株存在：①上游引物F1在P片段中，下游引物F2在leu2 CDS序列以证明敲除片段整合到基因组上；②上游引物L1在P片段上游，下游引物L2在leu2 CDS序列以证明敲除片段整合到目的基因位点；③上游引物R1在P片段中，下游引物R2在敲除基因CDS序列以证明目的基因不存在基因组。单基因敲除菌株3组PCR验证结果见图2。

注: M.Marker； A(polf-Δpox2). F1中pox2-F1/F2为引物，L1中pox2-L1/L2为引物，R1中pox3-R1/R2为引物；B(polf-Δpox3).F2中pox3-F1/F2为引物，L2中pox3-L1/L2为引物，R2中pox3-R1/R2为引物；C(polf-Δpex10).F3为pex10-F1/F2为引物，L3为pex10-L1/L2为引物，R3为pex10-R1/R2为引物；Ⅰ.假阳性菌株；Ⅱ.正确敲除菌株；Ⅲ.阳性对照菌株polf-pINA1296，下同。

图2单基因敲除菌株3组PCR验证结果

由图2可知，相对于Ⅰ系列假阳性菌株，Ⅱ系列菌株敲除组件整合到目的基因的位点，是正确基因交换的转化子polf-Δpox2。综上，polf-Δpex10、polf-Δpox2、 polf-Δpox3 3株缺陷型菌株构建成功。

2.3 pox2和pox3双基因敲除菌株的验证

在polf-Δpox2菌株基础上再敲除pox3基因，实验需要先切除polf-Δpox2菌株中的标记基因leu2，即转入Cre酶表达质粒使2个lox位点发生重组来切除标记基因。Cre表达质粒带有潮霉素B抗性，所以首先要确定菌株对潮霉素B抗性质量浓度，为300 μg/mL。polf-Δpox2Δpox3重组菌株PCR验证结果见图3。

由图3A1可知，9个转化子在500 bp左右均有条带，说明Cre表达质粒成功转入。由图3A2可知，相对于阳性对照菌，9株菌在1 500 bp处均没有条带，说明YPG培养基诱导Cre重组酶表达，切除leu2基因。之后将重组菌在YPD培养基中传代5～10次，丢失Cre表达质粒。得到菌株polf-Δpox2/leu-，在此菌株上转入PLT-pox3敲除组件以敲除pox3基因。由3对引物的PCR图谱(图3B)可知，相对于Ⅰ系列假阳性菌株，Ⅱ系列菌株是正确基因交换的转化子。因此，polf-Δpox2Δpox3双基因敲除菌株构建成功。

注: A1.转入Cre表达质粒验证；A2.leu2切除后验证;B(polf-Δpox2Δpox3).F2中pox3-F1/F2为引物，L2中pox3-L1/L2为引物，R2中pox3-R1/R2为引物；Ⅰ为假阳性菌株；Ⅱ为正确敲除菌株；Ⅲ为阳性对照菌株polf-pINA1296;M.Marker；NC.阴性对照；PC.阳性对照。

图3polf-Δpox2Δpox3重组菌株PCR验证结果

2.4 基因敲除菌株培养基水平鉴定

以油酸为唯一碳源在相同条件下分别培养5株重组菌株，对基因敲除菌株培养基水平进行鉴定，其生物量水平见表1。

表1 菌株在 YPO中生物量

由表1可知，polf-Δpox2、polf-Δpox3、 polf-Δpox2Δpox3均可以利用油酸作为碳源进行生长，但利用油酸的能力有差异，相对于阳性对照菌株生物量分别减少了0.6、2.5、4.6 g/L。而polf-Δpex10不能利用油酸，这说明敲除pex10基因切断了油酸的β氧化。这与前人实验结果一致[10]。因此，推测polf-Δpex10对于脂质的积累效果更好。

2.5 基因敲除菌株生长特性分析

基因敲除对酵母细胞的生长情况具有一定的影响[17]，为了比较不同重组菌株的生长特性，本文对其生长曲线分别进行测定，结果见图4。

由图4可知，基因敲除菌株在生长初期生长速度较慢，且进入稳定期时间也较正常菌株延迟了5 h左右，这说明基因的敲除使得酵母的生长能力减弱。其中polf-Δpex10菌株达到稳定期的OD600为11，低于其他菌株，主要是因为该菌株敲除的基因是过氧化物酶体相关因子，使得菌株的细胞器过氧化物酶体受损[9]。因此，pox2和pox3基因的敲除影响了菌株的生长速度，而pex10基因的敲除使菌体的生长速度和菌体总量都受到了干扰。

图4 菌株生长曲线

2.6 基因敲除菌株利用挥发性脂肪酸的能力分析

来源于食品废弃物以及各种可生物降解有机废弃物中的VFAs作为一种潜在的廉价碳源可以替代葡萄糖用于产油微生物积累脂质。耶氏解脂酵母能够利用VFAs作为唯一碳源进行生长，胞内乙酰辅酶A合成酶将VFAs直接转化为乙酰辅酶A，然后用于脂肪酸的生物合成[14]。但是VFAs初始质量浓度若高于5 g/L将对菌体生长产生抑制效应[14, 18-19]，因此本实验在培养基中添加5 g/L的VFAs替代YPD中的葡萄糖进行摇瓶培养。结果见图5。

由图5可知，5株菌株在YPV液体培养基中培养，均可以利用VFAs作为唯一碳源进行生长。polf-Δpox2、polf-Δpox2Δpox3和阳性对照菌株在发酵72 h左右VFAs基本耗尽，而polf-Δpex10、polf-Δpox3在接近发酵末期时出现此现象，说明pox3、pex10基因的敲除影响了解脂耶氏酵母对短链脂肪酸的吸收利用，这主要是由于pox3基因表达的酰基辅酶A(Aox3)对短链脂肪酸(C4～C10)有活性[20]；而pex10基因调控的是过氧化物酶体(脂肪酸β氧化的场所)的合成因子，基因敲除后影响了重组菌株利用短链脂肪酸能力。

图5 菌株在YPV培养基中VFAs含量

菌体利用VFAs的效率不同，其生物量和总脂产量也有所区别，结果见图6。

由图6可知，菌体生物量均随着发酵时间的延长呈现先增长后稳定的趋势，polf-Δpox3菌株的生物量明显低于其他菌株，为6.0 g/L左右。总脂方面，polf-Δpox2，polf-Δpox3总脂产量随着发酵时间延长先增长后下降，表明pox2、pox3基因分别敲除不能抑制脂肪酸的β氧化作用；而polf-Δpox2Δpox3、polf-Δpex10总脂产量在达到最高点之后下降的趋势并不明显，分别稳定在0.4 g/L和0.3 g/L左右。主要由于pox2和pox3基因的双敲除抑制菌株对胞内长链脂肪酸的降解[20]，而pex10的敲除破坏了过氧化物酶体，抑制了菌株对胞内脂肪酸的利用[10]。

3 结 论

本实验成功构建了4株解脂耶氏酵母β氧化基因敲除菌株。其中polf-Δpex10相对于另外3株菌株，生长能力较弱，且无法在油酸培养基上生长。说明pex10基因敲除虽影响了自身生长，但对长链脂肪酸β氧化抑制效果更佳。

以挥发性脂肪酸(VFAs)作为唯一碳源进行摇瓶培养，4株重组菌株均可以利用VFAs作为唯一碳源进行生长，但是吸收能力有所区别，polf-Δpox2、polf-Δpox2Δpox3吸收效率较高，polf-Δpox2Δpox3和polf-Δpex10总脂产量在发酵后期没有明显下降，更有利于脂质的积累。

综上所述，polf-Δpox2Δpox3, polf-Δpex10可以利用挥发性脂肪酸生长并可以积累大量的脂质而不被迅速降解，是理想的菌株。

[1] BARTH G, GAILLARDIN C. Physiology and genetics of the dimorphic fungusYarrowialipolytica[J]. Fems Microbiol Rev, 1997, 19(4): 219-237.

[2] BEOPOULOS A, MROZOVA Z, THEVENIEAU F, et al. Control of lipid accumulation in the yeastYarrowialipolytica[J]. Appl Environ Microb, 2008, 74(24): 7779-7789.

[3] LIU H H, JI X J, HUANG H. Biotechnological applications ofYarrowialipolytica: past, present and future [J]. Biotechnol Adv, 2015, 33(8): 1522-1546.

[4] BEOPOULOS A, CESCUT J, HADDOUCHE R, et al.Yarrowialipolyticaas a model for bio-oil production [J]. Prog Lipid Res, 2009, 48(6): 375-387.

[5] LUO Y S, NICAUD J M, VAN VELDHOVEN P P, et al. The acyl-CoA oxidases from the yeastYarrowialipolytica: characterization of Aox2p [J]. Arch Biochem Biophys, 2002, 407(1): 32-38.

[6] LUO Y S, WANG H J, GOPALAN K V, et al. Purification and characterization of the recombinant form of acyl CoA oxidase 3 from the yeastYarrowialipolytica[J]. Arch Biochem Biophys, 2000, 384(1): 1-8.

[7] SUMITA T, IIDA T, HIRATA A, et al. Peroxisome deficiency represses the expression ofn-alkane-inducible YIALK1 encoding cytochrome P450ALK1 inYarrowialipolytica[J]. Fems Microbiol Lett, 2002, 214(1): 31-38.

[8] PRESTELE J, HIERL G, SCHERLING C, et al. Different functions of the C3HC4zinc RING finger peroxins PEX10, PEX2, and PEX12 in peroxisome formation and matrix protein import [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(33): 14915-14920.

[9] TITORENKO V I, SMITH J J, SZILARD R K, et al. Peroxisome biogenesis in the yeastYarrowialipolytica[J]. Cell Biochem Biophys, 2000, 32(2):1-6.

[10] XUE Z X, SHARPE P L, HONG S P, et al. Production ofomega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering ofYarrowialipolytica[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 734-741.

[11] MADZAK C, GAILLARDIN C, BECKERICH J M. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeastYarrowialipolytica: a review [J]. J Biotechnol, 2004, 109(1/2): 63-81.

[12] FICKERS P, GAILLARDIN C, NICAUD J M, et al. New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeastYarrowialipolytica[J]. J Microbiol Meth, 2004, 55(3): 727-737.

[13] MADZAK C, TRÉTON B, BLANCHIN-ROLAND S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeastYarrowialipolytica[J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2000, 2(2): 207-216.

[14] FEI Q, CHANG H N, SHANG L A, et al. The effect of volatile fatty acids as a sole carbon source on lipid accumulation byCryptococcusalbidusfor biodiesel production [J]. Bioresour Technol, 2011, 102(3): 2695-2701.

[15] 贾益群, 叶福媛, 王双，等. 生物样品中短链脂肪酸的快速提取与分析方法 [J]. 实验室研究与探索, 2012 (7): 262-264.

[16] ZHANG B X, RONG C C, CHEN H Q, et al. De novo synthesis oftrans-10,cis-12 conjugated linoleic acid in oleaginous yeastYarrowiaLipolytica[J]. Microb Cell Fact, 2012, 11(1):51-59.

[17] WINZELER E A, LIANG H, SHOEMAKER D, et al. Functional analysis of the yeast genome by precise deletion and parallel phenotypic characterization [J]. Novart Found Symp, 2000, 229:105.

[18] FONTANILLE P, KUMAR V, CHRISTOPHE G, et al. Bioconversion of volatile fatty acids into lipids by the oleaginous yeastYarrowialipolytica[J]. Bioresour Technol, 2012, 114(3):443-449.

[19] YAHARA G A, JAVIER M A, TULIO M J M, et al. Modeling of yeastBrettanomycesbruxellensisgrowth at different acetic acid concentrations under aerobic and anaerobic conditions [J]. Bioproc Biosyst Eng, 2007, 30(6): 389-395.

[20] WANG H J, LE DALL M T, WACHE Y, et al. Evaluation of acyl coenzyme A oxidase (aox) isozyme function in then-alkane-assimilating yeastYarrowialipolytica[J]. J Bacteriol, 1999, 181(17): 5140-5148.

ConstructionofYarrowialipolyticamutantwithβ-oxidationgeneknockoutandutilizationofvolatilefattyacids

NI Lijuan，ZHANG Baixi，CHEN Wei，ZHANG Hao

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

In order to inhibit theβ-oxidation of long-chain fatty acids inYarrowialipolyticaand accumulate fatty acids stably, four recombinant strains withβ-oxidation gene knockout were constructed by gene regulatory pathway. The ability of recombinant strains accumulating large amount of long-chain fatty acids with volatile fatty acids as carbon source was studied. The results showed that pox2, pox3, pex10，pox2 and pox3 were successfully knocked out, and four recombinant strains could grow with volatile fatty acids. Compared with the original strain, the total yield of lipid (long-chain fatty acids) of polf-Δpox2Δpox3 and polf-Δpex10 did not decrease significantly byβ-oxidation of long-chain fatty acids in the later stage of fermentation, so they could utilize volatile fatty acids and achieve lipid accumulation.

Yarrowialipolytica;β-oxidation; long-chain fatty acid； volatile fatty acid

Q93;TQ92

A

1003-7969(2017)11-0083-06

2017-02-17；

2017-07-17

国家自然科学基金青年基金项目(31501457)

倪丽娟(1991)，女，硕士，研究方向为食品生物技术(E-mail)lijuanicole@163.com。

张 灏，教授，硕士(E-mail)zhanghao@jiangnan.edu.cn。