乳液颗粒度对中性蛋白酶酶解反应影响的研究

俞 明，钱俊青，龚 峰，郭 辉(浙江工业大学 药学院, 杭州 310014)

油料蛋白

乳液颗粒度对中性蛋白酶酶解反应影响的研究

俞 明，钱俊青，龚 峰，郭 辉
(浙江工业大学 药学院, 杭州 310014)

探索了1398中性蛋白酶酶解大豆乳液的反应速率受乳液颗粒度的影响。以1398中性蛋白酶在温度45 ℃、pH 7.0、加酶量120 U/mL(以乳液计)条件下，发现随着筛网目数(80～160目)增大，即颗粒度减小，其反应速率逐渐增大，200 目与160 目的乳液参与酶促反应的速率相近。根据反应起始至5 h内反应速率随乳液颗粒度变化的实验数据，拟合了不同酶解时间段乳液颗粒度与反应速率的关系式，由关系式曲线与实验值符合情况可知，在反应1 h之内及4～5 h之间，乳液颗粒度对反应速率影响的规律基本一致，而在反应1～4 h间为另一种规律。根据拟合关系式，可指导和优化大豆水相酶法提取大豆油的工艺。

蛋白酶；反应速率；颗粒度；大豆乳液；水相酶法

为同时利用油料的油脂和蛋白质，1956年Suganman[1]创立了以水作为溶剂，按照浓缩蛋白的生产工艺，分别将油和蛋白质从花生中分离出来的工艺，其中蛋白质含油9%～10%，且总提油率不高。在此之后，研究人员经过进一步的研究，可使提油率达到70%以上，蛋白质中的含油量下降到了4.0%[2]。此方法适用于含油量高的油料，如芝麻、油菜籽、花生等。对于含油量低的油料，如大豆，得到的油非常少[3]。

为此，有学者提出在水相体系中用酶提取油脂的方法，解决含油量低油料提油率低的问题，而且能够分离低变性蛋白质，达到提取油脂和获得无毒蛋白质二者的兼顾。Sharma等[4]研究了水酶法提取米糠油以提高油脂的得率。钱志娟等[5]建立了玉米胚芽水酶法提取油脂及蛋白质的新工艺，对热处理工艺进一步优化，在酶最适条件下依次加入酸性蛋白酶和纤维素酶，提油率可达到91.0%。

以酶法加工天然产物，大多在乳液体系中进行， Tano-Debrah等[6-7]研究了可可豆乳液及牛油果乳液酶解提取油脂工艺。Sengupta等[8]研究了米糠与芥菜籽水酶法提油的方法。刘志强等[9]在花生蛋白乳液中酶法提取蛋白质及油脂。赵大庆等[10]研究了榛子仁乳液分离蛋白酶解提取油脂的工艺，并采用正交实验对工艺进行优化。赵国华[11]、肖凯军[12]等分别研究了酶解玉米蛋白及大豆分离蛋白乳液对其性能的改善。以上研究中，涉及了工艺条件对酶促反应速率的影响，但乳液颗粒度对酶促反应速率的影响却未展开研究。因此，研究乳液颗粒度对酶促反应速率的影响具有非常必要的意义。

本文以1398中性蛋白酶在大豆乳液中的酶解反应为例，开展了乳液颗粒度对酶解反应速率影响的研究工作。考察80～200 目的大豆乳液对酶促反应速率影响，根据反应起始至6 h内的实验数据，拟合各时间段中乳液颗粒度与反应速率的关系式，以期指导和优化大豆水相酶法提取大豆油的工艺。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆：市售(浙江产)，水分12.4%，粗脂肪18.6%，粗蛋白质40.5%。1398中性蛋白酶：食用级，酶活120 000 U/g，无锡酶制剂厂。HH5214-B型电热恒温水浴锅，ZF40型自分离磨浆机，pH-2型酸度计。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆乳液制备

大豆粗粉碎至20目，固液比为1∶4，调pH为9.0，在50 ℃浸泡1.5 h，水磨，调节不同磨浆细度，以80～200目的筛网压滤，滤渣用大豆等质量的水冲洗并压滤，冲洗两次，滤液合并，得不同颗粒度的乳液，其中固形物含量最终均控制为8.57%。

1.2.2 不同颗粒度对乳液体系中酶促反应速率的影响

不同颗粒度的大豆乳液按1398中性蛋白酶在大豆乳液中酶解的最佳条件，即调pH为7.0，1398中性蛋白酶加酶量为120 U/mL，在温度45℃的水浴条件下反应，在不同的时间段可测得对应的蛋白质水解度，通过公式求得酶促反应速率[13]，反应速率的变化可通过考察颗粒度体现。

1.2.3 大豆乳液固形物含量的测定

大豆乳液的固形物含量按每100 mL溶液中含有多少克干固物表示，固形物质量由烘干后重量法测得。

1.2.4 蛋白质水解度的测定

水解度的测定采用文献[14]的方法。

水解度=游离—NH2的含N量/样品总含N量×100%，游离—NH2含N量测定可用甲醛滴定法[15]，采用凯氏定氮法测定样品总含N量。

2 结果与讨论

2.1 乳液颗粒度对酶促反应速率的影响

按照1.2.2实验方法，酶解固形物含量相同但颗粒度不同的大豆乳液，反应持续6 h，在不同酶解时间条件下，蛋白质水解度及通过水解度计算相应的酶促反应速率，结果分别见图1、图2。

图1 不同颗粒度乳液在不同酶解时间下的水解度

图2 乳液颗粒度对酶促反应速率的影响

由图1可知，在80～160目范围内，单位时间内乳液蛋白的水解度随着乳液颗粒度的减小而增加。超过160目之后的乳液，在条件不变的情况下，其蛋白质水解度并未明显提高。说明乳液颗粒大小达到一定程度后，蛋白质水解反应速率趋势稳定。随着反应时间延长，进一步提高了蛋白质的水解度。酶解时间在4 h以上，颗粒较小的乳液其蛋白质水解度变化不大，而颗粒较大的乳液蛋白质水解度提高速度增加。这可能是因为在酶解4 h后，因酶解破坏了颗粒较大固形物的结构，从而更有利于酶解反应的进行。

实验中，反应体系中固形物含量和酶用量是一致的，按照米氏方程的描述，反应速率在此相同条件下是一样的。不过图2结果所示，乳液颗粒度不同而固形物含量相同的乳液，在酶解时间一样的情况下，相应的酶促反应速率有很大的差异，表明酶促反应速率受乳液颗粒度的影响很大。在反应5 h之内基本呈现的是颗粒度越小，酶促反应速率越大的趋势。但颗粒度达160目以后，随着颗粒度的减小反应速率的提高速度趋于平缓甚至有些出现下降趋势。不同反应时间段，乳液颗粒度对反应速率的影响也不一样，80目的乳液体系在3 h内反应速率逐渐加快，之后减慢；颗粒度100目的乳液体系开始4 h左右反应速率逐渐下降，随后又缓慢上升；而颗粒度120目以上的体系反应速率是随反应进行而逐步变慢。在反应初始阶段，由于酶解作用，颗粒度较大的乳液颗粒结构被破坏，反应接触面积增加，加快了速率，随后因酶受抑制及失活等原因占主导，引起反应速率下降，随着反应进一步进行，颗粒结构进一步被破坏，反应速率又缓慢回升。而颗粒较小的乳液反应速率随反应的进行由于酶抑制及失活等原因逐渐下降，与溶液体系类似。

2.2 不同反应时间段乳液颗粒度对酶促反应速率影响的基本规律

本实验探究在5 h内，随着酶解时间变化，酶促反应速率受乳液颗粒度影响，且具有一定的变化规律，具有指导实际应用的作用。实验值曲线由图2中5 h内不同颗粒度对酶促反应速率影响所知，拟合在不同反应时间段下，乳液颗粒度与反应速率的关系式y=y0+a×e(80-x)/49.3，式中：x为固形物颗粒度(目)；y为酶促反应速率，μmol/min；y0、a分别为与酶解时间相关的常数。

不同时间段乳液颗粒度对反应速率关系式曲线与实验值比较结果见图3。

由图3(a)、(b)可知，酶解时间在1 h之内，由于时间较短，乳液中固形物颗粒结构并未被显著破坏，颗粒度对反应速率影响的拟合关系式与实验值能较好符合；而图3(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)表明在反应较长时间后，即酶促反应在1～4 h间，拟合关系式与实验值有一定的偏差。出现上述现象的原因可能是反应开始乳液的固形物颗粒结构具有一定的破坏；由图3(i)、(j)可知，在反应4～5 h范围内，酶解时间过长，固形物颗粒基本被破坏完全，其对反应速率的影响理论值和实验值也能够较好符合。

图3 乳液颗粒度影响酶促反应速率的实验值与拟合方程曲线

3 结 论

(1)乳液颗粒度对乳液体系中酶促反应速率有重要的影响，酶解时间越短，不同颗粒度乳液的反应速率相差越大。在80～160目范围内，随着目数增加，即颗粒度变小，反应速率增加。160目以上并无显著的影响。

(2)不同酶解时间段，其反应速率受颗粒度的影响有一定差异，在反应开始的1 h内及4～5 h，颗粒度对反应速率影响的规律较一致，而反应时间在1～4 h间，又有相似的影响规律。酶解时间在1 h之内以及在4～5 h范围内，其拟合关系式与实验值具有较好的吻合。酶解时间在4 h以上，颗粒较小的乳液其蛋白质水解度变化不大，所以可选择蛋白酶水解乳液时间为4 h。此实验得出的结论对于指导和优化水相酶法提取大豆油和大豆蛋白的酶解实验具有重要意义。

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Effectofparticlesizeofemulsiononenzymatichydrolysisreactionof1398neutralprotease

YU Ming, QIAN Junqing, GONG Feng, GUO Hui
(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The effect of particle size of emulsion on the reaction velocity of 1398 neutral protease hydrolyzing soybean emulsion was studied. The enzymatic hydrolysis reaction of 1398 neutral protease was carried out at 45℃, pH 7.0 and enzyme dosage 120 U/mL (based on emulsion). It was found that the reaction velocity increased with particle size increasing from 80 to 160 meshes (particle size decreasing), and the reaction velocity of 200 meshes emulsion was approximate with 160 meshes emulsion. According to experimental data of velocity change with particle size from reaction beginning to 5 h, the equation of particle size of emulsion with reaction velocity in different reaction time was fitted. Comparing the equation curve with experimental data, the law of particle size of emulsion influencing on reaction velocity in 1 h was consistent with that in 4-5 h, while it was different from that in 1-4 h. Based on the fitted formulas, it could direct and optimize the process of extraction of oil from soybean by aqueous enzymatic method.

protease; reaction velocity; particle size; soybean emulsion; aqueous enzymatic method

2016-12-21;

2017-06-22

俞 明(1991)，男，硕士研究生，研究方向为油脂、酶催化(E-mail)yuba23@sina.com。

钱俊青，教授，博士生导师(E-mail)302015815@qq.com。

TS229;TS206

A

1003-7969(2017)10-0043-04