高效液相色谱检测酱油中乙酰磺胺酸钾

刘超，陈艳，邹沫君，徐阳，唐琨

（四川省乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

高效液相色谱检测酱油中乙酰磺胺酸钾

刘超，陈艳，邹沫君，徐阳，唐琨

（四川省乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

本文改进了酱油中乙酰磺胺酸钾的检测方法。建立了以ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×100mm，3.5mm）为液相色谱柱；以乙腈、10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）为流动相；检测波长为280nm；流速为1.0mL/min的检测方法。讨论了滤出液和洗脱液体积的选择。结果表明，乙酰磺胺酸钾在0～0.5μg/mL范围内具有良好的线性，检出限为1.43μg/mL，加标回收率为92.1%～97.5%。与国标方法相比，该方法提高了方法检出限、准确度及精密度。

酱油；乙酰磺胺酸钾；高效液相色谱

乙酰磺胺酸钾化学名称为6-甲基-1,2,3-氧恶嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧钾盐；6-甲基-2,2-二氧代-1,2,3-氧硫氮杂；6-甲基-1,2,3-氧恶嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧钾盐，又称为安赛蜜、A-K糖，甜度为蔗糖的200倍。乙酰磺胺酸钾对光、热（能耐225℃高温），pH值适用范围较广，是目前稳定性最好的甜味剂之一[1，2]，其生产工艺不复杂、价格便宜、性能优于阿斯巴甜，被认为是最有前途的甜味剂之一。我国规定安赛蜜可用于饮料、冰淇淋、糕点、蜜饯、焙烤食品等的生产和制备[3]。

目前我国发布的关于乙酰磺胺酸钾的检测方法仅有GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》[4]，此检测方法是乙酰磺胺酸钾测定的基本方法，但是该方法中使用中性氧化铝层析柱，会影响检测结果的准确度、精密度和检测效率。因此本文采取市售的中性氧化铝柱代替中性氧化铝层析柱，优化了前处理过程，取得了良好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水：GB/T6682规定的一级水；

乙酰磺胺酸钾标准品 （0.25g、99.0%，Lot：40409 04/2018Dr.Ehrenstorfer GmbH，06/2018）；中性氧化铝柱（1000mg/3mL）；

无水硫酸镁：研磨后在500℃马弗炉内烘5h，200℃时取出装瓶，贮于干燥器中，冷却后备用；

键合硅固相萃取吸附剂PSA：粒度40～70μm；键合硅固相萃取吸附剂C18：粒度46μm。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，岛津公司DGU-20A，配有紫外检测器；

分析天平（精确度0.01mg），CP225D，德国赛多利斯集团；

固相萃取仪，ASE-12；

高速离心机，TD420，四川蜀科仪器有限公司；微孔滤膜，水相，0.22μm。

1.3 标准溶液的制备

1.3.1 乙酰磺胺酸钾标准储备液

称取0.01g乙酰磺胺酸钾标准品，加水溶解并定容至10mL，此溶液浓度为1mg/mL。

1.3.2 乙酰磺胺酸钾标准中间液

准确移取25μL乙酰磺胺酸钾标准储备液，用水稀释并定容至25mL，此溶液浓度为1μg/mL。

1.3.3 乙酰磺胺酸钾标准工作溶液

根据需要将乙酰磺胺酸钾标准中间液，用试样空白溶液稀释成浓度为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL 的标准工作溶液。

1.3.4 试样的提取

吸取2.5mL酱油试样置于10mL离心管中，加水定容至刻度，取5mL试样溶液至10mL离心管中，称取150mg PSA、300mg无水硫酸镁、300mg C18粉末至此离心管中，涡旋混匀1min，混匀后于4000r/min离心10min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，用10mL流动相（1+1）洗脱，收集全部洗脱液，合并滤出液和洗脱液，用水定容至25mL容量瓶中，过0.22μm滤膜，供液相色谱仪测定使用。

1.4 色谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse PlusC18（4.6mm×100mm，3.5mm）；进样体积 10μL；流速 1.0mL/min；柱温 40℃；检测波长280nm；流动相A为10mmol/L乙酸铵（pH=4），流动相B为乙腈。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.4.2 色谱分析

由自动进样器吸取净化后的样品溶液10μL，注入色谱仪中，以保留时间定性，以外标法定量。

2 结果讨论

2.1 滤出液体积的选择

试验中采用接收滤出液体积分别为全部接收、接收5mL、接收0mL来进行加标回收试验，结果见图1。由图可知，当全部接收滤出液时，回收率最高，为96.8%；当接收滤出液为5mL时，回收率为64%；当接收体积为0mL时，回收率为37.6%。可能的原因是试样中的乙酰磺胺酸钾经过中性氧化铝柱，除少部分残留在小柱上，其余全部流出，而干扰物则全部留在中性氧化铝柱上。因此，本试验采用全部接收滤出液体积。

图1 不同滤出液体积对应的回收率

2.2 流动相的选择

不同实验室配备的设备型号不同，因此只有摸索出适合本实验室最佳色谱条件才能保证最佳的分析效果。同时比较了GB/T 5009.140-2003[4]中流动相A：10mmol/L乙酸铵（pH=4）和B：乙腈作为流动相，从峰型、灵敏度、配置流动相的方便性和经济性、节约试剂等方面考虑，最终选择A：10mmol/L乙酸铵（pH=4）、B：乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，这与20mmol/L乙酸铵溶液-甲醇（体积比95∶5）文献报告相吻合[5]。

2.3 洗脱液体积的选择

吸取2.5mL酱油试样置于10mL离心管中，加水定容至刻度，混匀后于4000r/min离心10min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，试验中采用洗脱液体积分别为 0mL、3mL、5mL、10mL、15mL 流动相洗脱，做加标回收实验。结果见图2。由图可知，洗脱液体积为0mL时，回收率为82.5%；3mL时，回收率为88.4%；5mL时，回收率为93.3%；10mL时，回收率为98.9%；15mL时，回收率为98.3%。由此可见，当洗脱体积10mL时，已经完全将乙酰磺胺酸钾洗脱下来。从节约的角度出发，流动相的洗脱体积选择10mL。

图2 不同洗脱液体积对应的回收率

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围的确认

以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，得到标准曲线回归方程如表2所示。

表2 乙酰磺胺酸钾标准曲线回归方程

由本试验线性相关系数（0.9994）＞0.999可知，试验在0～0.5μg/mL浓度范围内，线性关系良好。

2.4.2 方法检出限的确认

由自动进样器吸取0.3μg/mL的标准工作溶液10μL，注入色谱仪中，平行进样3次，计算信噪比的平均值。

进样量为 3ng，信噪比分别为（1）32.8；（2）31.2；（3）30.8

仪器检出限：

由本试验的方法检出限可知，相比较GB/T 5009.140-2003《饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》[4]，本方法提高了灵敏度。

2.4.3 加标回收率

将乙酰磺胺酸钾储备液稀释至10μg/mL，准确吸取9份混匀的试样各2.5mL酱油试样置于10mL离心管中，分别准确移取0.05mL、0.3mL、0.6mL上述乙酰磺胺酸钾溶液各3份至9份试样中，加水定容至刻度，混匀后，取5mL试样溶液至10mL离心管中，称取150mg PSA、300mg无水硫酸镁、300mgC18粉末至此离心管中，涡旋混匀1min，混匀后于4000r/min离心10min，上清液全部转移至中性氧化铝柱中，收集全部滤出液，用10mL流动相（体积比1∶1）洗脱，收集全部洗脱液，合并滤出液和洗脱液，用水定容至25mL容量瓶中，过0.22μm滤膜，供液相色谱仪测定。

式中：C1-测得的加标样品中乙酰磺胺酸钾的浓度，ng/mL；

C2-测得的空白基质样品中乙酰磺胺酸钾的浓度，ng/mL；

M-稀释向的加标质量，ng。

由表3可知，该方法回收率为92.1%～97.5%。由回收率可知，本试验在加标质量在0.5～6.0μg范围内，回收率良好。

2.4.4 精密度

乙酰磺胺酸钾中间液稀释成0.1μg/mL标准溶液，由自动进样器吸取净化后的样品溶液10μL，注入色谱仪中，记录色谱图，测定峰面积，计算出RSD值，结果如表4所示。由表4可知，该方法精密度RSD为0.57%，这表明精密度良好。

表3 乙酰磺胺酸钾加标回收率

表4 乙酰磺胺酸钾精密度

[1]卢丽明,黄诚,周日东.饮料中乙酰磺胺酸钾的高效液相色谱测定法[J].职业与健康,2008,24(15)∶1520-1521.

[2]关瑾.甜味剂的应用现状及发展前景 [J].当代化工,2002,31(2)∶89-91.

[3]中华人民共和国卫生部.GB2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京∶中华人民共和国卫生部,2014.

[4]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.140-2003饮料中乙酰磺胺酸钾的测定[S].北京∶中华人民共和国卫生部,2003.

[5]郭友珍,王志宏.同时测定碳酸饮料中苯甲酸钠、山梨酸钾和安赛蜜的高效液相色谱法[J].分析测试学报,2001,20(4)∶67-68.

The Determination of Acesulfame Potassium in Soy Sauce Using HPLC

LIU Chao,CHEN Yan,ZOU Mo-jun,XU Yang,TANG Kun
(Leshan Institute for Food and Grug Control,of sichuan province,Leshan 614000,China)

The determination of Acesulfame potassium in soy sauce was improved.The method in this paper was developed based on paper HPLC column ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×100mm,3.5mm)with acetonitrile and 10mmol/L ammonium acetate (pH=4.0)as mobile phase,with flow rate at 1.0mL/min and UV detection wavelength at 280nm.A good linear was between 0～0.5μg/mL.The detection limit was 1.43μg/mL.Adding standard recoveries were between 92.1%～97.5%.The recovery and detection limit were improved.

Soy sauce;acesulfame potassium;HPLC

O657.7+2

A

1008-1038(2017)11-0030-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.11.008

2017-07-03

刘超（1984—），男，工程师，研究方向为食品安全