芸苔素内酯对“紫香”无核葡萄糖代谢及相关酶活性的影响

王萌 ，南立军，郁松林

（1.石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄 675000）

芸苔素内酯对“紫香”无核葡萄糖代谢及相关酶活性的影响

王萌1，南立军2*，郁松林1

（1.石河子大学农学院，新疆石河子 832000；2.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄 675000）

本文以“紫香”无核葡萄为试材，探讨外援激素对葡萄果实糖代谢及其相关酶活性的影响，采用不同浓度（CK、T1、T2、T3）的芸苔素内酯花后三次处理葡萄果穗后，测定果实发育过程中的葡萄糖、果糖、蔗糖、总糖和糖代谢相关酶活性等指标。结果表明：芸苔素内酯在果实转色期能够明显增加糖的积累速率，T2处理对各类糖的影响最明显；但采收期，芸苔素内酯对糖的积累产生的影响不明显。整个试验期间，所有样品的酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）活性呈现下降趋势，T2处理的变化较大，但是到成熟期三种处理的转化酶活性基本降到一致。整个试验期间，蔗糖合成酶（SS）活性呈现上升趋势，T2处理的SS活性上升最快。而T2处理的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在果实转色期最强，但是在成熟期，T1处理的SPS活性变为最强。总体上，芸苔素内酯能够改变果实相关酶活性，调控葡萄糖的积累及代谢，其中T2芸苔素内酯处理的效果最好。

芸苔素内酯；紫香无核；果实发育；糖代谢；酶活性

葡萄（Vitis viniferaL.）属于葡萄科葡萄属，为落叶藤本植物，栽培历史悠久，是世界最古老的植物之一，广泛分布于热带、亚热带、温带，经济价值高。新疆地域辽阔，昼夜温差大，日照资源丰富，是最佳的葡萄种植区之一。新疆葡萄种植面积居全国之首，随着葡萄种植面积的迅速增加，对生产、管理技术提出了更高要求，所以葡萄品质的提高成为葡萄生产和科学研究的重点。有学者提出，果实品质很大程度上取决于果实体内积累糖的种类及含量。果糖、葡萄糖和蔗糖是葡萄中主要的糖类，影响葡萄的成熟。因而，果糖、葡萄糖和蔗糖积累是葡萄果实内在品质形成的关键；蔗糖代谢是糖积累的重要环节[1]。蔗糖代谢酶（酸性转化酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶）是调节蔗糖转化、合成的关键酶[2]。

芸苔素内酯是具有植物生长调节作用的甾醇类化合物，化学结构与动物雄性激素、副肾皮质激素、雌性激素、昆虫蜕皮激素等同源，被认为是一种不同于其他生长调节剂的新型植物生长调节剂。梁芳芝等[3]报道芸苔素内酯能提高大豆的产量，斯尚松等[4]研究表明，芸苔素对花生叶面喷施可提高植株活力，大幅提高产量。白克智[5]研究发现，作为一种新型甾体植物激素，芸苔素内酯具有促进作物生长、增加作物产量、提高作物的耐寒性和耐盐能力的作用，可以提高葡萄、西瓜等的产量；刘伟等[6]实验也表明，适宜浓度的芸苔素内酯浸种或茎叶喷施对花生幼苗的萌发和生长具有促进作用。

目前，激素对葡萄果实糖代谢的影响已有初步研究，但是芸苔素内酯对葡萄果实糖含量及蔗糖代谢酶活性影响方面的研究迄今未见系统报道。本试验以紫香无核为试材，用不同浓度的芸苔素在不同时期处理葡萄果实，分析葡萄浆果发育过程中可溶性糖含量及相关酶活性的变化特点，明确芸苔素内酯参与葡萄果实糖积累的酶学机理，通过测试果实发育过程中的理化指标，探讨其对葡萄果实生长发育、糖含量及蔗糖代谢相关酶活性的影响，为芸苔素内酯对糖类物质的输入、积累、代谢及其调控研究提供一定的理论基础，提高其品质提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年5月10日～9月10日在石河子大学农学院试验站标准葡萄示范园进行。试材为3年生“紫香”无核白，株行距为1m×3m。植株生长健壮，正常管理。

1.2 实验处理

实验共设3个梯度浓度处理，分别为T10.5mg/L、T21.0mg/L、T31.5mg/L芸苔素内酯，以喷施清水为空白对照（CK）。紫香无核葡萄始花期为5月26日，盛花期为6月1日，落花期为6月5日。花后每7d喷施一次，共喷施3次。具体喷施时间依次为6月12日、6月19日和6月26日上午10点之前，避开高温、大风及雨天天气。

1.3 测定指标

取果时间以花后40d开始，共计取果6次，具体时间依次为7月15日、7月25日、8月5日、8月15日、8月25日和9月5日。

1.3.1 葡萄糖、果糖、蔗糖、总糖的测定

参照参考文献7的方法，用0.1mg/mL的葡萄糖标准品制备标准曲线，分别取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的葡萄糖标准液于干净的试管中，用蒸馏水补至1.0mL，然后加由81%浓硫酸配制的0.05%蒽酮溶液5mL，摇匀，沸水浴15min，放置20min后用1cm吸收皿于最大吸收波长下测吸光值，同时做空白实验。蔗糖测定采用分光光度法[8]，向20mL的容量瓶中分别加入一定量的蔗糖标准溶液，15mL新配置的18%的盐酸，加入蒸馏水定容至20mL，震荡5s，沸水浴8min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，用1cm吸收皿在285nm处测定吸光值。每个样品设3次取样重复[7]。

1.3.2 蔗糖代谢酶活性的测定

参照杨转英等[9]和Gordon[10]的方法，略加改进。试验均在0～4℃条件下进行测定，3次重复，酶活性单位为mg/(g·h·FW)。

中性转化酶和酸性转化酶活性的测定：用3,5-二硝基水杨酸法。反应产生的还原糖含量以0.2mL酶液沸水浴10min作为对照。用二者的差值计算还原糖产生速率，表示转化酶的活性。

蔗糖磷酸合成酶活性测定：取100μL酶液加入100μL的反应液，反应液的组成为0.1mmol/LHepes缓冲液（pH 8.0）、10mmol/L UDP-葡萄糖、5mmol/L果糖-6-磷酸、15mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、15mmol/L MgCl2、1mmol/L EDTA，34℃反应1h，加入0.2mL的30%KOH，转入沸水浴10min终止反应，冷却至室温。采用恩酮法测定反应产生的蔗糖，以沸水浴杀酶100μL酶液为对照。用二者的差值来计算蔗糖的合成量，表示蔗糖磷酸合成酶活性。

1.4 数据处理

数据取平均值，采用Microsoft Excel和SPPS17.0进行数据处理、制图和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 芸苔素内酯对葡萄果实发育过程中糖的影响

2.1.1 对葡萄糖的影响

由图1可知，在“紫香”无核白葡萄果实发育过程中，各处理明显改变了葡萄果肉组织中葡萄糖积累的变化趋势。从花后40d开始，葡萄糖积累速率减缓，T1出现W型的缓慢下降-上升趋势。除此之外，T2的葡萄糖含量有所提高，增幅是对照的3.31%，T3的葡萄糖含量有所降低，降幅是对照的3.22%。而在果实转色之后至果实成熟（花后 80～90d），T1、T2处理果实的葡萄糖积累速率高于对照，尤其T2处理最明显，从3.2g/L上升到了4.34g/L。这表明，T2对葡萄果实葡萄糖含量的影响最明显，并且三个处理对葡萄果实中葡萄糖含量的影响大小依次为T2、T1、T3（T3低于对照）。

图1 芸苔素内酯对葡萄果实中葡萄糖含量的影响

2.1.2 对果糖的影响

通常情况下，在果实发育初期，果糖的变化较小，不存在显著差异。图2为“紫香”无核白果实中果糖含量的变化趋势。在果实转色过程中，各处理的果糖积累速率均比对照快，在转色期（花后50d），T1处理果实的果糖含量比对照降低了3.9%，T2和T3处理果实的果糖含量分别比对照提高了4.23%和0.99%，各处理间差异显著，而各处理与对照的差异达到极显著水平。在转色之后对照果实中果糖的积累速率相对较快，从2.05g/L上升到了9.34g/L，上升了7.29g/L，T1从4.55g/L上升到了9.24g/L，上升了4.69g/L，T2从5.02g/L上升到了9.56g/L，上升了4.54g/L，T3从 4.33g/L上升到了 8.9g/L，上升了 4.57g/L，表明，芸苔素内酯对果糖的积累速率效率主要在转色前，应该尽早喷施芸苔素内酯，同时，芸苔素内酯的最佳喷施浓度为T2，因为T2处理的每个时期的果糖含量均是最高的，但在果实成熟至采收（花后90d），对照和各处理果实中果糖积累速率均有所减缓，这表明，葡萄的成熟与外源芸苔素内酯没有直接关系，只与葡萄品种有关。

图2 芸苔素内酯对葡萄果实中果糖含量的影响

2.1.3 对蔗糖的影响

图3显示了在葡萄果实整个发育过程中，蔗糖含量基本呈现出较低水平的变化趋势。

图3 芸苔素内酯对葡萄果实中蔗糖含量的影响

由图3可以看出，从果实进入第二次生长期开始（花后40d），葡萄果实中蔗糖的积累速率缓慢增加，葡萄果实经芸苔素内酯处理后，明显促进了蔗糖的积累速率。在花后第40d，经三种芸苔素内酯处理的果实的蔗搪积累速率明显高于对照，其含糖量由高到低分别为T2＞T1＞T3＞CK，分别比对照提高了 37.5%、17.5%和 10.0%，T2处理与T1和T3处理之间差异显著，并且各处理与对照的差异极显著（P＜0.01），在果实成熟过程中，T2处理对果实蔗糖的影响最明显，其次是T1处理和T3处理。随着果实的成熟，尤其是花后90d开始，经三种处理的果实的蔗糖含量基本趋于一致，表明蔗糖的积累最终与品种有关，芸苔素内酯只是在前期影响葡萄果实中蔗糖的积累。

2.1.4 对总糖的影响

“紫香”无核葡萄果实生长发育过程中，总糖的含量基本呈持续增长趋势。由图4可知，经处理的葡萄果实总糖的变化趋势与对照相似。在花后40d开始，可溶性总糖的积累速率由快变慢，在花后60d达到低谷，之后快速上升，在花后90d达到最高。而对照在整个时期呈现明显的上升趋势。花后45d，各处理（T1、T2和 T3）果实的可溶性总糖含量分别高于对照87.87%、106.38%和81.28%。而花后90d，T2处理高于对照0.64%，T1和T3处理分别下降了7.37%和7.51%。处理之间差异显著（P＜0.05），而T2与对照之间差异极显著 (P＜0.01)，直到果实成熟时（花后90d），可溶性总糖含量最终上升到最高，并且T2处理的葡萄果实中总糖含量与对照相似，而之后T1和T3处理的葡萄果实中总糖含量均低于对照，表明T2处理能够更好的积累总糖。

图4 芸苔素内酯对葡萄果实中总糖含量的影响

2.2 芸苔素内酯对葡萄果实发育过程中蔗糖代谢酶活性的影响

2.2.1 对酸性转化酶（AI）的影响

果实中的转化酶包括酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两类。由表1可知，在果实发育前期，AI酶活性保持较高水平增加，在花后第50d达到最大值，即出现高峰，此后逐渐降低，使用芸苔素内酯处理显著提高了果实生长过程中AI的活性。从花后40d到果实成熟，除了T2处理的葡萄果实中AI活性高于对照外，T1和T3处理的葡萄果实中AI活性有时低于对照，有时高于对照，但是总体上低于对照。在果实成熟后，除T2外，T1和T3分别比对照低5.26%和2.63%，且差异不显著。因此，T2处理对葡萄果实中AI活性的影响最高，与对照差异达到极显著水平（P＜0.01），这是T2处理葡萄果实中糖含量最高的原因。

表1 芸苔素内酯对酸性转化酶活性的影响mg/（g·h·FW）

2.2.2 对中性转化酶（NI）的影响

在果实发育的整个过程中，经处理果实的NI和对照的变化趋势基本一致（如表2）。在葡萄果实发育前期，各处理NI活性总体低于CK，分别比对照低了15.38%、10.25%和 23.08%，尤其是 T3最为明显，且 T2＞T1＞T3。三种处理和对照都在花后50d达到了最大，然后呈现V型上升，再下降至一致。但随着果实发育到后期，各处理与对照之间差异减小，并在果实成熟时，几乎达到一致，表明和糖一样，芸苔素内酯只是在生长期对中性转化酶（NI）有显著影响。

表2 芸苔素内酯对中性转化酶活性的影响mg/（g·h·FW）

2.2.3 蔗糖合成酶（SS）

表3（见下页）显示葡萄果实中蔗糖合成酶（SS）酶随着果实的生长发育呈波动性的变化。由表可知，在花后第40d蔗糖合成酶（SS）开始上升，此后快速上升，在第70～80d上升到最高，然后有一些明显的下降。在葡萄果实发育前期，T1和T2处理蔗糖合成酶（SS）活性高于CK，分别比对照高了6.56%、22.95%，而T3处理的蔗糖合成酶（SS）活性低于CK，比对照低了31.14%，并且芸苔素内酯对蔗糖合成酶（SS）的影响由高到低依次为 T2、T1、T3。在花后第90d，果实开始成熟后SS活性又开始下降，使用芸苔素内酯后明显提高了T2处理的葡萄果实中SS的活性，尤其在花后90d，T2处理的果实中SS活性比对照高5.61%。因此，T2处理有利于葡萄果实中SS的活性的提高。

表3 芸苔素内酯对蔗糖合成酶的影响mg/（g·h·FW）

2.2.4 蔗糖磷酸合成酶（SPS）

果实中SPS活性呈先上升后下降的趋势。T3处理的葡萄果实中SPS活性的变化趋势不明显，T2的变化趋势最明显，即T2＞T3＞T1（表4）。从表4可以看出，初期，芸苔素内酯对蔗糖磷酸合成酶（SPS）的影响依次 T2＞T3＞T1，成熟期，芸苔素内酯对蔗糖磷酸合成酶（SPS）的影响依次T1＞T2＞T3。无论是初期还是成熟期，三种处理的葡萄果实中的蔗糖磷酸合成酶（SPS）的活性都高于对照，表明芸苔素内酯对葡萄果实中蔗糖磷酸合成酶（SPS）的影响是非常明显的，但是在成熟期不明显了。在花后60～70d，外源植物激素对葡萄果实发育过程中糖代谢及相关酶活性的影响达到高峰，此后又开始波动性的变化，在花后90d降低到了低谷。同样使用芸苔素内酯提高了SPS的活性，在葡萄浆果成熟期（花后第 90d），Tl、T2和 T3处理的SPS活性分别比对照高36.84%、10.53%和5.26%，处理之间差异表现极显著（P＜0.01）。

表4 芸苔素内酯对蔗糖磷酸合成酶（SPS）的影响mg/（g·h·FW）

2.3 芸苔素内酯对葡萄糖果实淀粉积累及分解酶活性的影响

果实发育期间，SS既能促进果实中蔗糖的降解，又能促进果实中蔗糖的增加，是促进果实中蔗糖的降解还是增加，取决于SS酶降解方向的活力强还是合成方向酶的活力强。本实验中，前期SS酶活性上升，但是蔗糖含量是下降的，表明SS酶降解方向的活力强。中期，蔗糖含量和SS酶活都上升，表明SS酶合成方向的活力强。后期，SS酶活性下降，蔗糖含量又开始上升，这除了与SS活性有关外，与SPS活性的上升也有关（表3和表4）。SPS活性的上升促进了蔗糖含量的提高。不同时期，SS的作用不一样，有时候需要SPS和SS的协同作用完成糖的代谢。为了保持植物“库一源”之间糖的浓度梯度，一方面，蔗糖进入果实后会尽快转化为葡萄糖、果糖或淀粉，另一方面贮藏在细胞内[11]。本试验中蔗糖、果糖和葡萄糖含量都在增加，表明，在蔗糖转化为葡萄糖、果糖的同时，仍然有蔗糖的合成，这与SS和SPS活性的上升有关。一方面，SS促进了蔗糖转化为葡萄糖、果糖，另一方面，SPS促进了蔗糖的合成。

众所周知，葡萄果实膨大后期，可溶性总糖含量的迅速提高是浆果总糖含量较高的一个重要原因。有研究表明，赤霉素（GA3）能诱导α-淀粉酶的生成，促进淀粉水解，增加糖浓度[12]，也可提高蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的活性，这与本试验中芸苔素内酯在采收前的作用相似；外源GA3能使植物体内淀粉类物质降解，为果实发育提供丰富的能量底物与碳糖，因此，芸苔素内酯也有相同的作用。而座果和幼果发育主要是依赖植株贮藏的营养物质，外源激素加速了酶促反应，从而促进坐果与果实发育[13]。本实验前期的糖含量呈上升趋势，进一步证实，芸苔素内酯与GA3有相同的作用。

蔗糖合成酶（SS）是第一个限速酶。在果实发育期间，蔗糖在SS催化下产生的磷酸葡萄糖进入造粉体，成为淀粉合成的主要底物[14]。本试验结果发现，果实发育前期，SS分解活性稳步上升，蔗糖含量下降，葡萄糖和果糖含量上升，这表明从韧皮部转运来的蔗糖被分解为果糖和葡萄糖。果糖在胞质内转变为磷酸果糖或丙酮酸醋，用于果实呼吸与体内物质合成，促进果实膨大。因此，葡萄果实中糖分的积累与蔗糖合成酶密切相关。

3 小结

本试验通过分别在6月12日、6月19日、6月26日对“紫香”无核萄果实各喷施一次芸苔素内酯，研究了芸苔素内酯对“紫香”无核葡萄果实生长过程中的葡萄糖、果糖、蔗糖、总糖及相关酶活性等指标的变化，结果表明：果实生长发育过程中糖代谢相关酶的活性经芸苔素内酯处理后均得到显著提高，尤其是T2处理的最明显，果实的糖分积累也受到相应影响，尤其是果糖、葡萄糖、总糖，但并没有改变糖积累总的变化规律。芸苔素内酯对糖分的影响主要体现在转色前加快了糖的积累速率。同样，蔗糖含量在果实发育早期及转色期增加显著，在后期维持较高水平，但差异并不显著。果实发育前期转化酶活性增大，后期合成酶酶活性增加，SS增加明显，SPS增加不明显。

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Effects of Brassinolide on Sugar Metabolism and Related Enzymatic Activity of Purple Sweet Seedless Grape

WANG Meng1,NAN Li-jun2*,YU Song-lin1
(1.College of Agronomy,Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2.School of Chemistry and Life Sciences,Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China)

In this paper,the effects of exogenous hormone on sugar metabolism and some enzyme activities in grape were studied.After flowering,different concentrations of exogenous brassinolide (CK,T1,T2and T3)were used to deal with cluster of purple sweet seedless grape three times.The indexes of glucose,fructose,sucrose,total sugar and enzyme activities related to glucose metabolism were determined during fruit development.The results showed that brassinolide could enhance sugar aecumulation level during the veraison,T2treatment of which was the most obvious for accumulation of sugars,however there no obvious change until harvest time.During the whole experiment period,the activities of acid invertase (AI)and neutral invertase (NI)decreased in all samples,especially T2.In the maturity stage,however,the activities of invertase in three treatments were basically the same.The activity of sucrose synthase (SS)increased and the activity of SS increased fastest in T2treatment.However,the activities of sugar phosphate synthase (SPS)varied with different treatments:In colour-changed period,T2was the strongest;and in mature period,T1was the strongest.Overall,the change of the related enzyme activity could adjust accumulation and metabolism of sugar in grape fruit,1.0mg/L brassinolide treatment was the best consideration.

Brassinolide;purple sweet seedless grape;berry development;glycometabolism;enzyme activiy

S663.1

A

1008-1038(2017)11-0014-06

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.11.004

2017-08-19

王萌（1980—），男，硕士研究生，专业方向为园艺学

觹通讯作者：南立军（1973—），男，讲师，研究方向为葡萄与葡萄酒学