甘露消毒丹及其拆方对柯萨奇病毒A16小鼠模型P—选凝素糖蛋白配体1和促炎因子的影响

邹俊驹+吴佳敏+贺又舜+伍参荣+赵国荣

摘要：目的 觀察甘露消毒丹及其拆方对柯萨奇病毒A16型（CoxA16）小鼠模型P-选凝素糖蛋白配体1（PSGL-1）和促炎因子的影响，探讨其抗病毒的作用机制。方法 7日龄ICR小鼠150只，随机分为正常组、模型组、全方组、芳残方组、清残方组和利残方组，每组25只。除正常组外，其余各组小鼠腹腔注射20 μL 107TCID50的CoxA16标准株原液进行造模。除正常组和模型组外，其余各组给予相应药物干预。于给药后第10日取材，检测PSGL-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-4的表达，并进行病理组织观察。结果 除正常组外，其余各组小鼠肌肉组织内存在大量CoxA16，表明造模成功；HE染色结果显示，甘露消毒丹及其拆方可减轻CoxA16对肌肉的损伤。与正常组比较，模型组PSGL-1蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，全方组、芳残方组、清残方组和利残方组不同程度抑制PSGL-1蛋白的表达，减少致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-4的产生（P<0.01）。结论 甘露消毒丹及其拆方具有抗炎作用，其中以全方组效果最明显。

关键词：甘露消毒丹；拆方；P-选凝素糖蛋白配体1；促炎因子；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0042-05

Effects of Ganlu Xiaodu Pills and Its Residues on PSGL-1 and Proinflammatory Cytokines in CoxA16 Mouse Model ZOU Jun-ju， WU Jia-min， HE You-shun， WU Can-rong， ZHAO Guo-rong （College of TCM， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Ganlu Xiaodu Pills and its residues on PSGL-1 and proinflammatory cytokines in Coxsackie virus A16 （CoxA16） mouse model； To discuss its antiviral mechanism of action. Methods Totally 150 ICR mice at age of 7 days were randomly divided into normal group， model group， all-side group， aromatic residual group， clearing residual group and removing residual group， with 25 mice in each group. Except for normal group， other groups were injected intraperitoneally with 20 μL of 107TCID50 CoxA16 standard stock solution to establish models. Except for normal group and model group， other groups were given relevant medicine for intervention. The expressions of PSGL-1， TNF-α， IL-1β and IL-4 and histopathological observation were detected after 10 days of medication. Results Except for the normal group， the existence of a large number of CoxA16 in other groups of mouse muscle tissues proved successful modeling. HE staining showed that Ganlu Xiaodu Pills and residual could reduce damage to the muscle by CoxA16 virus. Compared with the normal group， the expression of PSGL-1 protein in the model group increased （P<0.01）； compared with the model group， all-side group， aromatic residue group， clearing residual group， removing residual group inhibited the expression of PSGL-1 protein， reduced the inflammatory factors of TNF-α， IL-1β， and IL-4 （P<0.01）. Conclusion Ganlu Xiaodu Pills and its residues have anti-inflammatory effects， and the all-side group shows the best efficacy.

Key words： Ganlu Xiaodu Pills； residual； PSGL-1； proinflammatory cytokines； miceendprint

手足口病是一类由肠道病毒引起的急性传染病，

基金项目：国家自然科学基金（81173188）

通讯作者：贺又舜，E-mail：youshunh@sina.com

其中柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）2种最为常见[1]。近年来，手足口病在我国出现多次大范围爆发，对我国儿童的健康造成严重威胁。因此对于手足口病的临床特征及最常见病原体的生物学特性、致病机理及疫苗开发等研究日益关注。前期研究发现，甘露消毒丹能抑制柯萨奇病毒在细胞内的复制，并且能在细胞外影响病毒的吸附和穿入[2-3]，通过调节淋巴细胞亚群，诱导IFR3的表达，刺激免疫细胞分泌干扰素（IFN）-γ，达到抗肠道病毒目的[4]。本课题组前期研究发现，由甘露消毒丹演变出的各种拆方，其治疗效果各有优势，如：甘露消毒丹化浊利湿残方在调节免疫功能方面有优势，甘露消毒丹化浊利湿残方擅长于控制炎症反应方面等[5-6]。本研究在前期研究基础上，以甘露消毒丹抗CoxA16病毒作用为切入点，探讨甘露消毒丹及其拆方对CoxA16小鼠模型P-选凝素糖蛋白配体1（PSGL-1）和促炎因子的影响，探讨其相关作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级ICR小鼠150只，3日龄，体质量（3±1）g，动物许可证号SYXK（湘）2013-0005，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于室温（30±0.5）℃、相对湿度（90±5）%的环境，采用12 h/12 h明暗光照，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

甘露消毒丹全方（简称“全方”）：滑石15 g，黄芩10 g，茵陈11 g，石菖蒲6 g，川贝母5 g，木通5 g，藿香4 g，连翘4 g，豆蔻4 g，薄荷4 g，射干4 g；甘露消毒丹清热解毒残方（简称“清残方”）：黄芩 10 g，连翘4 g，薄荷4 g，射干4 g，川贝母5 g，甘露消毒丹芳香化浊残方（简称“芳残方”）：藿香4 g，石菖蒲6 g，豆蔻4 g；甘露消毒丹化浊利湿残方（简称“利残方”）：茵陈11 g，滑石15 g，木通5 g。上述药物及剂量均按照国家十二五高等中医药学教材《方剂学》[7]所载，购于湖南中医药大第一附属医院中药房，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定符合国家药典标准。各方加水适量，煎煮前先浸泡40 min，每次煎煮20 min，共煎煮2次，藿香、豆蔻、石菖蒲、薄荷在其他药煎煮15 min后再下，继续煎煮5 min即可。混合2次药液，置于65 ℃恒温水浴浓缩，全方、清残方、芳残方、利残方分别配制成含原药材1.44、0.54、0.28、0.62 g/mL，灭菌后4 ℃冰箱保存备用。给药剂量参考人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表[8]。

1.3 主要试剂与仪器

总RNA提取试剂盒（Rneasy Mini Kit），上海生工生物技术有限公司；SuperRT cDNA第一链合成试剂盒，上海生工生物技术有限公司；GoldStar TaqMan Mixture，康为世纪有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-4酶联免疫试剂盒，长沙丽欣生物技术有限公司。高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），超净工作台（上海生工生物工程公司），荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），-80 ℃超低温冰箱（美国Thereto公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

将实验小鼠随机分为正常组、模型组、全方组、芳残方组、清残方组和利残方组，每组25只。除正常组外，其余各组均快速解冻，CoxA16标准株原液腹腔注射20 μL 107TCID50造模[9-10]。造模第3日观察小鼠精神状态、活动度、体质量、毛发变化及死亡情况，记录每日体温、体质量。成模第4日，各给药组小鼠给予相应药物灌胃，0.2 mL/5 g，连续10 d。正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次。成模标准：通过外表观察初步判断染毒是否成功，其次通过病理切片观察染毒动物肺组织充血情况，判定染毒的稳定性，再利用定量PCR方法检测染毒动物组织中是否存在CoxA16 RNA。

2.2 标本采集与处理

实验小鼠分别于第0日（CoxA16标准株原液感染前）和感染后第3、5、8、10日取成活小鼠5只，乙醚吸入法麻醉小鼠，安乐处死。立即取后肢肌肉、大脑、小肠，部分置于4%中性多聚甲醛固定液中保存制作病理切片；部分置于2.5%戊二醛固定液中保存，用于电镜观察；再取部分后肢肌肉，用无菌4 ℃预冷的PBS和双抗（青霉素、链霉素）冲洗2～3次，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。HE染色：常规石蜡包埋，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，間断连续切片（厚度4 μm）、烤片、常规脱蜡，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察肌肉组织形态学变化。

2.3 一般观察

小鼠接种CoxA16标准株原液后每日观察记录小鼠表现，包括体质量的增减和临床症状：皮（毛）皱褶、驼背、消瘦、四肢乏力、肢体麻痹、抽搐、死亡等。并根据下述标准评分。0分：健康；1分：后肢无力；2分：一个肢体瘫痪；3分：一个以上肢体瘫痪；4分：死亡[11]。

2.4 Western blot检测P-选凝素糖蛋白配体1蛋白表达

取样本进行6%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转膜。转膜完毕，将膜置于封闭液中温室封闭5 min，用漂洗液漂洗1 min；将混匀的抗体与反应液HRP（鼠）混合液加入抗体稀释液中混匀（一抗以1∶200比例稀释，反应液HEP以1∶100比例稀释）；弃去漂洗液，将一抗、反应液及稀释液混合而成的抗体孵育液加到膜上，摇床孵育1 h；弃去抗体稀释液，用漂洗液洗3～5次，每次3 min；ELC法进行检测，进行图像扫描、灰度分析。以PSGL-1与β-actin的光密度比值表示PSGL-1蛋白的表达。实验重复3次，应用图像分析软件Image J进行光密度半定量蛋白质检测。endprint

2.5 肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-4细胞因子检测

将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。预估待测样品浓度，使其符合试剂盒的检测范围。分设标准孔、空白孔、待测样品孔，分别加入标准品、样品稀释液、待测样品100 μL至各孔，避免产生气泡。使用一次性封膜封板，37 ℃孵育80 min。吸去孔内液体，甩干。每孔加入100 μL工作液A，使用一次性封膜封板，37 ℃温育45 min。温育后洗板3次，用厚叠纸吸干水分。每孔加100 μL工作液B，用一次性封膜封板37 ℃温育45 min。温育后洗板5次，用厚叠纸吸干水分。依次加90 μL底物溶液至每孔，使用一次性封膜封板37 ℃避光显色。至反应时间依次加50 μL终止溶液至每孔，终止反应。于酶标仪波长450 nm处测定各孔OD值。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较方差齐者用方差分析，方差不齐者用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 模型验证

HE染色结果显示：正常组小鼠肌肉纹理清晰，组织无炎症浸润；模型组肌肉纹路紊乱，炎症因子大量浸润。见图1。表明在感染CoxA16病毒第4日，小鼠肌肉组织受到一定的损伤。造模第4日，PCR扩增曲线显示模型组小鼠后肢肌肉存在CoxA16病毒，正常组扩增曲线无明显变化，见图2。上述数据表明CoxA16导致小鼠感染CA16病毒的模型成功。

4.2 一般状况

小鼠接种CoxA16病毒后14 d，小鼠死亡数和疾病状态分别用存活率和临床疾病评分进行评价。实验中发现小鼠感染病毒1～2 d出现后肢软弱、无力；3～4 d出现1个肢体或2个肢体以上出现麻痹、瘫痪，甚至出现震颤、嗜睡、共济失调，严重者死亡，小鼠发病率100%。在临床疾病评分中，甘露消毒丹各残方组为0.8～2.1，全方组为0.3，见图3。甘露消毒丹各残方组小鼠存活率分别为80.31%、83.26%、65.11%，全方组为90.33%，模型组为35.26%，见图4。表明甘露消毒丹及其拆方能明显提高CoxA16感染小鼠的存活率与健康状态，且全方组效果最优，芳残方组和清残方组效果较利残方组佳。

4.3 病理观察结果

HE染色结果显示，正常组小鼠肌肉组织无炎症浸润，肌肉纹理清晰。各给药组炎症反应有所减轻，其中全方组效果最好，对病毒导致肌肉炎症浸润的消除和肌肉纹理的修复效果显著；清残方组和芳残方组能降低肌肉炎症浸润，利残方组能够提高肌肉纹理的修复但抗炎效果欠佳。结果见图5。

4.4 甘露消毒丹及其拆方对模型小鼠肌肉组织P-选凝素糖蛋白配体1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肌肉组织PSGL-1蛋白表达明显升高（P<0.01），表明机体在CoxA16感染性炎症刺激下，在白细胞从血液、血管壁定向迁移到炎症部位的过程中，肌肉组织内PSGL-1表达增强；与模型组比较，全方组和各残方组小鼠肌肉组织PSGL-1蛋白表达降低（P<0.01），全方组降低最显著。结果见图6、图7。

5 讨论

手足口病属中医学“春温”“湿温”等范畴，病因为外感时邪疫毒，内伤湿热蕴结，心火炽盛，其病位在肺、脾、心三脏。邪毒由口鼻而入，蕴郁肺脾，内侵生湿生热，向外发于肌表[12]。

选择素是一个细胞黏附分子家族，由3种细胞表面糖蛋白组成，包括白细胞表达的L-选择素、血管内皮细胞表达的E-选择素、血小板和内皮细胞表达的P-选择素。L-选择素是由白细胞基本结构性地所表达，而E-选择素和P-选择素由内皮细胞被诸如TNF-α、IL-1所诱导表达，是对炎症刺激的反应[13]。PSGL-1是选择素最具特征性的配体。PSGL-1是白细胞膜蛋白的唾液酸黏蛋白，其结构为含有二硫键亚单位的二聚体，能与3种不同的选择素结合[14]。在CoxA16感染性炎症刺激下，PSGL-1在白细胞从血液、血管壁定向迁移到炎症部位中起重要作用。

IL-4是由多种淋巴细胞和非淋巴细胞自发或在各种因素刺激下产生的，其中IL-4生物学活性广泛，在机体免疫调节、炎症反应、造血调控等过程中均发挥重要作用；IL-1β是一种经典的炎性因子，主要依赖于固有免疫细胞尤其是巨噬细胞内的Nalp3炎性小体成熟与分泌；在CoxA16感染的急性期，在神经源性肺水肿和脑炎患者的血清和脑脊液中检测到大量的IL-4、IL-1β和TNF-α[15]，表明促炎细胞因子与疾病的严重程度有明显的相关性，感染性炎症时，白细胞在选择素和α4整合素的介导下，定向地移行至被感染的组织。

本实验结果显示，在CoxA16感染性炎症刺激下，模型組PSGL-1的表达颇高，各给药组均可降低CoxA16模型小鼠体内PSGL-1的表达；而全方组、清残方组PSGL-1的表达量低于芳残方组和利残方组，其中全方组PSGL-1的表达量接近于正常组，显示甘露消毒丹全方的效果最好。从甘露消毒丹对CoxA16小鼠模型肌肉组织内TNF-α、IL-1β、IL-4的影响可以看出，全方组对于抗炎作用最显著，其次为清残方和芳残方，效果较低的是利残方，这可能与药物间的整体配伍产生的作用有关，全方组集清热解毒、芳香化浊、清利药物于一体，通过清理三焦达到整体调节作用；而清残方效果仅次于全方组，可能是清热解毒药对病因起到直接的治疗作用；芳残方效果次于全方组和清残方，却优于利残方，可能是因为芳香化浊药物可通过辟秽和中、芳化湿浊毒邪的功效而发挥疗效，但不能因此而忽略利残方的作用，利残方在全方中的作用颇为重要，否则湿邪秽浊无从导去，而且既往实验也表明，利湿化浊法及一些利湿化浊药物对病毒感染性疾病的疗效不仅包括对其病因的治疗，也包括对病因引起的一系列机体功能紊乱的矫正。所以，我们应当从整个方剂各药物间的配伍功效来分析全方的作用，并根据其不同作用效果来分析各个拆方药物的作用特点。其具体作用机制，今后将进一步从炎症通路方面进行研究。endprint

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（收稿日期：2017-02-03）

（修回日期：2017-03-19；编辑：华强）endprint