PM2.5致大鼠肺损伤及桔梗总皂苷干预作用的研究

姚琳+张俊威+孟庆杰+董坤+王伟明

摘要：目的 观察PM2.5致大鼠肺损伤及桔梗总皂苷（PGS）对其的干预作用，探讨PGS对PM2.5致肺损伤修复的机制。方法 采用气管滴注法染毒制作PM2.5致大鼠肺损伤模型。实验大鼠随机分为空白组、模型组和PGS高、中、低剂量组，每组10只。给药14 d后，收集肺泡灌洗液（BALF），采集大鼠左肺及右肺组织中叶，HE染色观察肺组织病理改变，ELISA检测BALF肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-13的含量；RT-PCR检测肺组织转化生长因子-β（TGF-β）mRNA的表达，免疫印迹法检测肺组织TGF-β的蛋白表达。结果 与模型组比较，PGS高、中剂量组BALF TNF-α、IL-6显著降低，IL-10、IL-13显著升高，PGS各剂量组大鼠肺组织炎细胞浸润减少，肺间质水肿和纤维增生减轻，肺组织TGF-β mRNA和蛋白表达降低。结论 PGS可能通过调节炎性细胞因子的平衡减轻PM2.5引起的肺组织炎症，并通过下调TGF-β的表达抑制肺纤维化进程，从而对PM2.5致大鼠肺损伤具有一定的保护及修复作用。

关键词：桔梗总皂苷；PM2.5；炎性细胞因子；转化生长因子-β；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.010

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0038-04

Study on Lung Injury of Rats Caused by PM2.5 and Intervention Effect of Platycodonis Radix Total Saponins YAO Lin， ZHANG Jun-wei， MENG Qing-jie， DONG Kun， WANG Wei-ming （Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）

Abstract： Objective To observe the lung injury of rats caused by PM2.5 and the intervention effect of Platycodonis Radix total saponins （PGS）； To discuss the repair mechanism of PGS for lung injury caused by PM2.5. Methods The model of lung injury caused by PM2.5 was induced by tracheal instillation. The rats were randomly divided into blank group， model group and PGS high-， medium- and low-dose groups， with 10 rats in each group. After medication for 14 d， BALF and left lung and right lung tissue of rats were collected. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The contents of TNF-α， IL-6， IL-10 and IL-13 in BALF were detected by ELISA. RT-PCR was used to detect the expression of TGF-β mRNA in lung tissues. The expression of TGF-β protein in lung tissue was detected by Western blot. Results Compared with model group， TNF-α and IL-6 decreased significantly while IL-10 and IL-13 increased significantly in BALF in high- and medium-dose group of PGS. Degree of pulmonary interstitial edema and fibroplasia alleviated in PGS groups. Expressions of TGF-β mRNA and protein in lung tissue was reduced in PGS groups. Conclusion PGS can alleviate inflammatory injury caused by PM2.5 via regulating the balance of cytokine and down-regulating the expression of TGF-β and inhibiting the development of fibrosis， which results in the protection and repair on the lung injury of rats caused by PM2.5.

Key words： Platycodonis Radix total saponins； PM 2.5； inflammatory cytokines； TGF-β； rats

PM2.5是大氣污染的主要成分，是影响身体健康的主要因素之一，近年来已成为研究的热点。越来越多的流行病学和毒理学资料表明，PM2.5与呼吸道疾病和慢性心肺疾病的发病率密切相关[1-3]。由于PM2.5endprint

基金项目：黑龙江省青年科学基金（QC2014C115）

通讯作者：王伟明，E-mail：342201601@qq.com

粒径小，可随气流进入呼吸道深部，沉积在终末细支气管和肺泡，通过刺激和作用肺泡巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞，造成肺部炎性损伤及纤维化[4]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6是机体内产生的重要促炎细胞因子，肺细胞在外源性物质刺激下，可以释放上述炎性因子，介导炎症反应。IL-10和IL-13作为抗炎细胞因子，分别抑制TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的合成。而转化生长因子-β（TGF-β）在肺纤维化发病机制中起着重要作用，其可促进成纤维细胞增殖和聚集，以及成纤维细胞表型向成肌纤维细胞表型转化[5]。桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，主要活性成分为总皂苷。本课题组预实验表明，桔梗总皂苷（PGS）能够明显减轻PM2.5引起的小鼠肺纤维增生，降低肺间质炎性细胞浸润。本实验采用气管滴注法染毒制作PM2.5致大鼠肺损伤模型[6]，观察PGS对PM2.5致大鼠肺损伤后TNF-α、IL-6、IL-10、IL-13及TGF-β表达的影响。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠50只，鼠龄4周，雌雄各半，体质量180～220 g，长春亿斯实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（吉）2011-0004。饲养于温度（22±2）℃、湿度（50±10）%，光照12 h/12 h明暗交替屏障环境。

1.2 药物及制备

桔梗，安国市奉义中药饮片有限公司，批号20141020，桔梗总皂苷纯度为84.62%（制备方法：桔梗以75%乙醇提取，提取浓缩液于AB-8型大孔吸附树脂柱，梯度乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱部位，回收，再以水饱和正丁醇萃取，干燥，即得）。给药前研磨成粉，溶解，涡旋混匀。

1.3 主要试剂与仪器

Trizol试剂（美国Invitrogen）公司，TGF-β、β-actin引物（哈尔滨博仕生物技术有限公司），TGF-β多克隆抗体（Abcam公司），高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司），PMSF（Calbiochem公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天公司），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天公司），PVDF膜（Millipore公司），IL-6、IL-10、IL-13及TNF-α ELISA试剂盒（Uscn公司）。SorvaⅡ ST16低温离心机（Thermo公司），KD-TS3A自动组织脱水机（浙江金华科迪仪器设备有限公司），KD-BM生物组织包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司），RM2235组织切片机（德国莱卡）；BX4-1生物显微镜（日本OLYMPUS公司），DP-72组织生物信号采集分析系统（日本OLYMPUS公司），Infinite M200 Pro酶标仪（Tecan公司），9600定量PCR检测仪（杭州博日），VersaDoc 400mp凝胶成像系统（BIO-RAD公司），DYCZ-24DN电泳槽（北京六一仪器厂），PowerPac Universal电泳仪（美国BIO-RAD公司），半干转膜仪（美国BIO-RAD公司）。

1.4 PM2.5采集及处理

PM2.5滤膜由哈尔滨市环境监测站提供。滤膜经超声洗脱处理后，收集PM2.5溶液，真空冷冻干燥后-20 ℃保存。临用前用生理盐水配成浓度为10 mg/mL的PM2.5混悬液。

2 實验方法

2.1 分组、造模及给药

大鼠适应性饲养7 d，分层随机分为空白组、模型组和PGS高、中、低（56、28、14 mg/kg）剂量组，每组10只，雌雄各半。除空白组外，其余各组采用气管滴注法染毒，染毒剂量10 mg/kg，每日1次，连续5 d。染毒第6日各组大鼠开始灌胃给药，PGS高、中、低剂量组给予相应浓度PGS溶液20 mL/kg灌胃，空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续14 d。末次给药后1 h，1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，收集肺泡灌洗液（BALF），-80 ℃冻存，用于检测IL-6、IL-10、IL-13及TNF-α含量；剪取左肺，置于4%甲醛中固定，用于病理组织学观察；取右肺中叶，-80 ℃冻存，用于提取RNA和蛋白质。

2.2 HE染色

取甲醛固定肺组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，石蜡包埋，切片，常规HE染色，镜下观察肺组织病理学变化。

2.3 大鼠肺泡灌洗液白细胞介素-6、10、13和肿瘤坏死因子-α测定

用ELISA试剂盒检测，严格按照说明书进行。

2.4 大鼠肺组织转化生长因子-β mRNA表达检测

实时荧光定量PCR检测TGF-β mRNA的表达。提取RNA，用酶标仪对RNA纯度及浓度进行测定，根据RNA浓度调整总RNA的体积，使各样品反转录体系所含RNA量相同，将RNA反转录为cDNA，以合成的cDNA为模板，进行PCR。引物序列：TGF-β上游5'-GGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游5'-GCCA CTCAGGCGTATCAG-3'；β-actin上游5'-CGTTGACA TCCGTAAAGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGT GAG-3'，引物长度18 bp。采用2-ΔΔCt法计算TGF-β/β-actin的相对表达量。

2.5 大鼠肺组织转化生长因子-β蛋白表达检测

按试剂盒说明检测蛋白浓度，相同蛋白浓度加入12%SDS-PAGE凝胶分离并转印到PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭3 h，加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，然后将膜与二抗稀释液室温摇床孵育1 h。最后用化学发光试剂显色，凝胶成像仪拍照分析。用 Quanity one图像分析软件分析条带的光密度值，用相对光密度值（TGF-β/β-actin）表示其蛋白表达量。endprint

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间均数比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 桔梗总皂苷对模型大鼠肺组织病理形态的影响

空白组肺组织基本正常。模型组肺部病变明显，外观充血、水肿，严重者肺叶分布散在大小不等的坏死灶，病变程度以模型组最重；病理学检查可见明显的炎症反应，肺泡腔变小，肺泡结构不完整，排列不规则，肺泡上皮细胞脱落，肺间质增厚纤维组织增生，肺间质炎性细胞浸润，支气管及血管周围有明显的淋巴细胞浸润。PGS各剂量组肺组织病变较模型组明显减轻，并随剂量的增加减轻更为明显，其中PGS高剂量组与空白组相近。见图1。

4.2 桔梗总皂苷对模型大鼠肺泡灌洗液白细胞介素-6、10、13及肿瘤坏死因子-α含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠BALF TNF-α、IL-6显著升高（P<0.01），IL-10、IL-13显著降低（P<0.01）；与模型组比较，PGS高、中剂量组大鼠BALF TNF-α、IL-6显著降低（P<0.05，P<0.01），IL-10、IL-13显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

4.3 桔梗总皂苷对模型大鼠肺组织转化生长因子-βmRNA和蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织TGF-β基因和蛋白表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，PGS各剂量组大鼠肺组织TGF-β基因和蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2、图2。

5 讨论

PM2.5对肺组织的影响，其病理学变化主要表现为炎性改变，严重者可引起肺纤维化，肺间质有大量的炎性细胞浸润，肺间隔增厚，毛细血管受损，细支气管和毛细血管周围亦有大量的炎性细胞浸润[7-9]。本实验PM2.5致肺损伤的模型复制再次验证其对肺损伤的作用，实验结果也表明PGS可明显减轻PM2.5致大鼠肺组织的炎症表现，肺组织形态结构趋向正常，损伤得到修复。

细胞因子是炎性反应中联系机体与损伤因子的枢纽，分为促炎因子和抗炎因子。前者包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12及近年新发现的IL-17、IL-23等，主要表现为促炎作用；后者包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）及各种促炎因子的可溶性受体等，主要表现为抑制炎症作用。促炎细胞因子与抗炎细胞因子相互作用形成复杂的网络，其动态平衡决定炎症的发展与结局[10]。其中，TNF-α、IL-6是机体内产生的重要促炎因子，具有增强各种炎性介质及使炎性细胞聚集的作用，过度和不适当表达均与炎症有关，是反映机体早期炎性反应的敏感指标；而IL-10、IL-13作为抗炎因子，可抑制TNF-α、IL-6的分泌。本实验结果表明，PGS能降低大鼠BALF TNF-α、IL-6的含量，并升高IL-10、IL-13的含量，提示PGS能够减轻PM2.5引起的大鼠肺部炎性损伤，可能是通过调节促炎和抗炎细胞因子间的平衡实现的。

TGF-β是一种多功能细胞因子，最初是从血小板中分离出来的，因其能促进成纤维细胞的转化生长而得名，主要由肺泡巨噬细胞和上皮细胞分泌。TGF-β能调控细胞生长、分化及细胞外基质的合成，在个体发育、免疫和炎症过程中都有重要作用[11]，目前被大多数学者认为是肺纤维化形成和发展的关键性细胞因子[12]，是迄今发现最强的细胞外基质沉淀促进剂。PM2.5通过呼吸进入呼吸道深部与肺组织接触，通过刺激和作用于肺泡巨噬细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞，促进TGF-β的分泌，使其表达增加。TGF-β首先通过超化炎症细胞参与肺损伤和炎症反应，然后主要是促进细胞外基质形成和抑制其酶解作用，促进纤维蛋白原向肌成纤维细胞转化，同时影响其他纤维化细胞因子，导致纤维化发生。本实验结果表明，PM2.5可导致大鼠肺组织TGF-β mRNA及蛋白表达升高，各给药组能够降低其表达，提示PGS可能通过降低TGF-β的表达，抑制肺纤维化进程，从而对肺损伤具有保护和修复作用。

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（收稿日期：2017-02-17）

（修回日期：2017-03-16；编辑：华强）endprint