锌、锰对微拟球藻生长及营养物质积累的影响

李 霞,于水见,梁荣荣,王 旎,管 斌

(1.青岛琅琊台集团股份有限公司,山东 青岛 266400;2.中国海洋大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 266003)

锌、锰对微拟球藻生长及营养物质积累的影响

李 霞1,于水见1,梁荣荣1,王 旎2,管 斌2

(1.青岛琅琊台集团股份有限公司,山东 青岛 266400;2.中国海洋大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 266003)

研究了不同质量浓度锌锰共同添加对微拟球藻(Nannochloropsis oculata)生长及营养物质积累的影响,结果表明,不同质量浓度的锌锰胁迫对培养液中藻细胞密度的影响和单个藻细胞中营养物质的积累不同。当培养液中Zn2+质量浓度为60 μg/L,Mn2+质量浓度为400μg/L时,藻细胞密度、蛋白质和粗脂肪含量最高,分别为8.5×108个/mL、0.59mg/mL和0.71mg/mL。当培养液中Zn2+、Mn2+质量浓度分别为40 μg/L和600 μg/L时,藻细胞密度为6.2×108个/mL,单个藻细胞中蛋白质含量和粗脂肪含量最高,分别为0.98×10-9mg和1.83×10-9mg。

微拟球藻;锌浓度;锰浓度;细胞生长;营养物质;积累

微拟球藻(Nannochloropsis oculata)是一类属于真眼点藻纲、球形或近似球形的单细胞真核生物,具有较高的光合作用效率、生物量和油脂含量,被认为是最有潜力的工业产油的模式研究藻种[1]。随着化石燃料的减少及环境污染的加剧,微藻生物柴油已成为人们关注的热点话题之一[2-4]。在微量元素较高或较低的逆境条件下,可能对单个藻细胞营养物质的积累起促进作用,但此时培养液中细胞密度较低,因此营养物质总量仍然较少[5]。在微拟球藻培养过程中,温度、光照、营养盐等因素都会影响藻细胞的生长及营养物质的积累[6-8]。迄今,众多研究集中在异养条件下,微量元素铁、硅、磷对微拟球藻的生长和油脂积累上[9-11],少有微量元素中锌、锰对微拟球藻生长及油脂积累的研究报道,因此,该研究以近海海域分离获得的一株微拟球藻(Nannochloropsis oculata)为研究对象,研究了不同锌、锰配比对异养条件下微拟球藻生长及油脂产量的影响,以期为提高微拟球藻产脂肪酸含量奠定基础,同时为微拟球藻生产油脂工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微拟球藻(Nannochloropsis oculata):由近海海域分离得到,经纯化培养获得纯藻种;考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、维生素B1、B12:美国Sigma公司;磷酸、硝酸钾、磷酸氢二钠、氯化钴、硫酸铜(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;氯仿(分析纯)、甲醇、乙醇(均为色谱纯):天津市科密欧化学试剂有限公司;生物素:上海生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

XA204电子天平:梅特勒-托利多仪器公司;5804R型离心机:德国Eppendorf公司;SW-CJ-1CM超净工作台、YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;QHX-250BSH型人工气候箱:上海新苗医疗器械公司;CX31型电子显微镜:日本奥林巴斯株式会社;16×25血球计数板:上海市求精生化试剂仪器有限公司;VG3S25涡旋振荡器:德国IKA公司;WFJ2100型可见分光光度计:尤尼柯仪器公司;AF-610E原子荧光光谱仪:北分瑞利分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基及培养条件

微拟球藻培养基采用改良的f/2培养基:KNO3100mg/L、NaH2PO4·H2O100mg/L、FeCl3·6H2O30mg/L、Na2EDTA·2H2O 4.36 mg/L、CuSO4·5H2O 0.05 mg/L、CoCl2·6H2O 0.02 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.07 mg/L、维生素B120.005 mg/L、维生素B10.001 mg/L、生物素0.005 mg/L。分别在改良的f/2培养基中添加不同浓度钙、锌、镁、锰离子的溶液,调整CaCl2溶液的质量浓度分别为20 μg/L、100 μg/L,ZnSO4·7H2O溶液的质量浓度分别为20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L,MgSO4·7H2O溶液质量浓度分别为100 μg/L、500 μg/L,MnCl2·4H2O质量浓度分别为100μg/L、200μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L。121 ℃灭菌20 min备用。

选上浮且活力强的微拟球藻作为藻种,按1∶5的比例接种到培养基中,培养液体积为100 mL,培养温度(25±1)℃,光照强度5 000 lx,光暗周期比为12 h∶12 h,培养10 d,每两天取样测定微拟球藻的细胞密度。单独以锌、锰元素为研究的情况,连续培养10 d后取样分别测微拟球藻的细胞密度、粗脂含量,比较不同锌锰浓度配比对微拟球藻生长及物质积累的影响。

1.3.2 微拟球藻生长测定及营养物质含量的测定

微拟球藻细胞数量测定采用血球计数板法[12];微拟球藻蛋白质含量测定采用Bradford法[13]。

藻粉干质量测定:取100mL藻液6000r/min离心15min,倒去上清,置于烘箱中烘干称质量,与初始离心管的质量之差即为100 mL藻粉干质量。

微拟球藻油脂含量的测定方法:取待测定的藻液100mL,6 000 r/min离心15 min,用蒸馏水反复洗涤3次,加入10 mL 0.02 mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液,超声破碎细胞。油脂的提取采用Bligh和Dyer法[14]并进行了改良。取10 mL破碎细胞,加入50 mL甲醇-氯仿(2∶1,V/V)、混匀后,再加入20 mL氯仿,20 mL 0.02 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液,混匀,静置过夜,分离下层溶液,用氯仿定容至10mL。取5mL定溶液于已称质量的铝碟,60℃烘干称质量,油脂含量计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 单一金属元素对微拟球藻生长的影响

2.1.1 钙对微拟球藻生长的影响

图1 CaCl2质量浓度对微拟球藻生长的影响Fig.1 Effect of CaCl2concentration on growth of Nannochloropsis oculata

设置CaCl2添加量分别为0、20 μg/L、100 μg/L,测定其对微拟球藻生长的影响,结果如图1所示。由图1可知,与对照组比较,CaCl2添加量为20 μg/L和100 μg/L的条件下,微拟球藻的生长整体状况几乎无差异,培养到第10天时,CaCl2添加量分别为0、20 μg/L、100 μg/L的细胞密度为7.31×108～7.45×108个/mL,细胞密度上下波动不大,表明钙是否添加对微拟球藻的生长几乎没有影响。

2.1.2 锌对微拟球藻生长的影响

设置ZnSO4·7H2O添加量为0、20 μg/L、100 μg/L,测定其对微拟球藻生长的影响,结果如图2所示。由图2可知,在不添加锌元素、20 μg/L和100 μg/L ZnSO4·7H2O的情况下,微拟球藻的生长差异显著。与对照组比较,20 μg/L的ZnSO4·7H2O有利于促进微拟球藻的生长,培养10 d后细胞密度达到7.67×108个/mL,较不添加锌元素的细胞密度高出3.5×107个/mL;ZnSO4·7H2O添加量为100 μg/L抑制了微拟球藻生长,培养到第10天时,细胞密度只有5.24×108个/mL。结果表明,ZnSO4·7H2O添加量为20 μg/L有利于促进微拟球藻的生长,若ZnSO4·7H2O添加量为100 μg/L反而抑制细胞生长,影响微拟球藻生长增殖。

图2 ZnSO4·7H2O质量浓度对微拟球藻生长的影响Fig.2 Effect of ZnSO4·7H2O concentration on growth of Nannochloropsis oculata

2.1.3 镁对微拟球藻生长的影响

图3 MgSO4·7H2O质量浓度对微拟球藻生长的影响Fig.3 Effect of MgSO4·7H2O concentration on growth of Nannochloropsis oculata

设置MgSO4·7H2O添加量为0、100μg/L、500μg/L,测定其对微拟球藻生长的影响,结果如图3所示。由图3可知,与对照组比较,MgSO4·7H2O添加量为100 μg/L条件下,微拟球藻的生长几乎无差异,培养10d,细胞密度为7.42×108个/mL;当MgSO4·7H2O添加量为500μg/L时,微拟球藻细胞生长受到抑制,细胞数量较对照组差异显著,培养到第10天时,细胞密度仅有4.04×108个/mL,较对照组降低45.6%。结果表明,在培养微拟球藻时,镁元素是否缺乏对微拟球藻的生长无影响。

2.1.4 锰对微拟球藻生长的影响

设置MnCl2·4H2O添加量为0、100 μg/L、500 μg/L,测定其对微拟球藻生长的影响,结果如图4所示。由图4可知,不添加和添加锰元素的情况下,微拟球藻的生长差异显著。与对照组比较,MnCl2·4H2O添加量为100μg/L有利于促进微拟球藻的生长,培养10 d后细胞密度达到7.98×108个/mL,较不添加锰元素的细胞密度高出5.5×107个/mL;而MnCl2·4H2O添加量为500 μg/L时,对微拟球藻细胞具有毒害作用,抑制微拟球藻生长,培养到第10天时,细胞密度为4.64×108个/mL。结果表明,MnCl2·4H2O添加量为100 μg/L有利于促进微拟球藻的生长,若MnCl2·4H2O添加量为500 μg/L时抑制了细胞生长,影响了微拟球藻细胞密度。

图4 MnCl2·4H2O质量浓度对微拟球藻生长的影响Fig.4 Effect of MnCl2·4H2O concentration on growth of Nannochloropsis oculata

综合图1～图4的结果表明,在微拟球藻培养过程中,微量元素钙、镁对促进细胞生长的影响极小,培养基中不需要添加该两种元素;而锌、锰元素对细胞生长影响较大,须进一步对锌、锰的添加量展开研究。

2.2 复合金属元素对微拟球藻生长的影响

2.2.1 锌、锰共同添加对微拟球藻生长的影响

单因素试验中,锌、锰的单独作用影响了微拟球藻的生长。两种元素的共同作用如图5所示。由图5可知,培养15 d后,测定不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O的培养液中微拟球藻的细胞密度。当锰质量浓度一定时,在一定范围内,藻细胞密度随锌质量浓度的增加而增大,当培养液中锌质量浓度为60 μg/L时,藻细胞浓度最大,继续增加培养液中的锌浓度,藻细胞密度开始降低。当锌质量浓度一定时,在一定范围内,随着培养液中锰质量浓度的增加,藻细胞密度不断增大,当锰质量浓度为400 μg/L时,藻细胞密度最大,继续增大锰质量浓度至600 μg/L,藻细胞密度开始降低。实验结果表明,锌、锰为微拟球藻生长所必须的营养盐,不同质量浓度组合影响培养液中藻细胞密度,当锌质量浓度为60 μg/L、锰质量浓度为400 μg/L时,藻细胞密度最高,为8.5×108个/mL。

图5 不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对微拟球藻细胞密度的影响Fig.5 Effect of ZnSO4·7H2O and MnCl2·4H2O concentration on algae cell density ofNannochloropsis oculata

2.2.2 锌、锰共同添加对微拟球藻蛋白质含量的影响

图6 不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对微拟球藻蛋白质含量的影响Fig.6 Effect of ZnSO4·7H2O and MnCl2·4H2O concentration on protein content ofNannochloropsis oculata

不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O共同对微拟球藻蛋白质含量的影响不同,结果如图6所示。由图6可知,当锰质量浓度一定时,随着锌质量浓度的升高,蛋白质含量的变化规律类似于锰浓度一定藻细胞密度的变化规律,蛋白质含量随锌质量浓度的增加而增大,当锌质量浓度为60 μg/L时,蛋白质含量达到最大,继续增加培养液中的锌质量浓度至80 μg/L时,蛋白质含量出现下降的趋势。说明锰含量一定时,缺锌会影响藻液中蛋白质的积累,但是锌质量浓度太高,同样也会抑制藻液中蛋白质的积累。当锌质量浓度一定时,蛋白质含量随锰质量浓度的增加而不断增大,当锰质量浓度为400 μg/L时,蛋白质含量最高,当锰质量浓度增加到600 μg/L时,蛋白质含量开始下降。当锌质量浓度为60 μg/L、锰质量浓度为400 μg/L时,培养液中蛋白质含量最高,为0.59 mg/mL。

为了搞清楚复合元素胁迫下单个藻细胞的蛋白含量与总细胞蛋白含量的变化规律是否一致,以期通过提高单个细胞的蛋白含量,从而提高整体高密度藻蛋白含量,考察不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O共同作用对单个藻细胞蛋白质含量的影响,结果如图7所示,其变化规律不同于培养液中蛋白质含量的变化规律。当培养液中锰质量浓度为100～200μg/L时,锌质量浓度为20μg/L有利于单个藻细胞蛋白质的积累,当锰质量浓度为400～600 μg/L时,锌质量浓度为40 μg/L的培养液中单个藻细胞蛋白质含量最高,为0.98×10-9mg,说明锰质量浓度一定时,较低的锌质量浓度(20～40 μg/L)能促进单个藻细胞蛋白质的积累,锌质量浓度过高反而会抑制微拟球藻中单个藻细胞中蛋白质的含量。说明锰质量浓度一定时,低质量浓度的锌胁迫会促进单个藻细胞中蛋白质的积累。当锌质量浓度一定时,单个藻细胞中蛋白质含量随锰质量浓度的变化规律与锰浓度一定时单个藻细胞随锌质量浓度的变化规律有所不同,当锌质量浓度较低为20 μg/L时,低质量浓度锰(100 μg/L)的培养基中单个藻细胞蛋白质含量最高,为0.87×10-9mg。当锌质量浓度为40～60 μg/L时,锰质量浓度为600 μg/L的培养基中单个藻细胞中蛋白质含量较高,最高为0.98×10-9mg,说明当锌质量浓度一定时,低质量浓度锰(100 μg/L)或高质量浓度锰(600 μg/L)能促进单个藻细胞中蛋白质的积累。当培养液中锌锰质量浓度组合为40 μg/L和600 μg/L时,微拟球藻单个藻细胞中蛋白质含量最高,为0.98×10-9mg,表明锌锰胁迫会促进单个藻细胞蛋白质的积累,但此时微藻细胞密度低,并不利于总蛋白含量的积累。

图7 不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对单个藻细胞蛋白质含量的影响Fig.7 Effects of ZnSO4·7H2O and MnCl2·4H2O concentration on protein content in single algae cell ofNannochloropsis oculata

2.2.3 锌、锰共同添加对微拟球藻粗脂肪含量的影响

不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对微拟球藻粗脂肪含量影响的结果如图8所示。当锰质量浓度一定时,随着锌质量浓度的增加,培养液中粗脂肪含量呈现先升高后降低的趋势,变化趋势类似于锰质量浓度一定时藻细胞密度的变化趋势,当锌质量浓度为60 μg/L时,培养液中粗脂肪含量最高,当锌质量浓度增加到80 μg/L时,粗脂肪含量开始降低。当培养液中锌质量浓度一定时,微拟球藻粗脂肪含量随锰质量浓度的变化规律类似于锰质量浓度一定时粗脂随锌质量浓度的变化规律,当锰质量浓度增加到400 μg/L时,微拟球藻的粗脂肪含量最高,锰质量浓度为100 μg/L和600 μg/L时,微拟球藻粗脂肪含量都较低,说明低质量浓度和高质量浓度的锰都会影响微拟球藻粗脂肪的积累。当培养液中锌、锰质量浓度分别为60μg/L和400μg/L时,培养液中粗脂肪含量最高。

图8 不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对粗脂含量的影响Fig.8 Effects of ZnSO4·7H2O and MnCl2·4H2O concentration oncrude lipid content ofNannochloropsis oculata

不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O的培养基对单个藻细胞粗脂肪含量的影响如图9所示。

图9 不同质量浓度ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O对单个藻细胞粗脂肪含量的影响Fig.9 Effects of ZnSO4·7H2O and MnCl2·4H2O concentration on crude lipid content in single algae cell ofNannochloropsis oculata

由图9可知,培养液中锌锰胁迫会促进单个藻细胞粗脂肪的积累,当锰质量浓度一定时,锌质量浓度为20～40μg/L的培养液中单个藻细胞的粗脂肪含量最高。当锌质量浓度一定时,锰质量浓度为100 μg/L和600 μg/L的培养液中单个藻细胞粗脂肪含量最高。锌质量浓度为40 μg/L、锰质量浓度为600 μg/L的培养基中单个藻细胞中粗脂肪含量最高。说明低质量浓度的锌胁迫会促进单个藻细胞粗脂肪的积累,低质量浓度和高质量浓度的锰胁迫会促进单个藻细胞中粗脂肪的积累。

2.3 小结

综合以上实验结果,发现当培养液中锌质量浓度为60μg/L,锰质量浓度为400μg/L时,藻细胞密度、蛋白质和粗脂含量最高,分别为8.5×108个/mL、0.59mg/mL和0.71mg/mL。此浓度组合能促进藻细胞的生长及培养液中蛋白质、粗脂的积累。当培养液中锌质量浓度降至40 μg/L,锰质量浓度增至600 μg/L时,微拟球藻单个藻细胞中蛋白质和粗脂含量最高,分别为0.98×10-9mg和1.83×10-9mg,表明培养液中锌锰胁迫会促进单个藻细胞中营养物质的积累,但培养液中藻细胞密度较低,影响了培养液中藻的总物质积累,所以为了提高营养物质的积累,需要保证高的微拟球藻细胞密度。

3 结论

藻类的生长和油脂的积累受到多种环境因素的影响,其中微量元素的添加量具有一定的作用,影响微藻的渗透压、对营养物质的吸收和悬浮性等。微藻根据周围环境因子的不同,为更好的适应环境,便通过调节油脂的代谢以适应周围环境,达到生存的目的[15-16]。一些藻类只在某些营养缺乏的时候,体内才会对油脂进行积累。但是在这种情况下,微藻的生长量也会随着降低,所以同时提高微藻生物量和油脂含量是研究的重点。从钙、镁、锌和锰四种微量元素出发,通过单因素试验做了钙、镁、锌和锰元素的添加对微拟球藻的生长影响,确定了在微藻培养中这钙和镁元素对其影响不大,锌和锰元素对微拟球藻的生长影响较大。

锌锰是藻类生长必不可少的微量元素,锌是光合作用和代谢相关酶类的组成成分,如碳酸酐酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶等,其中碳酸酐酶对水体中藻类吸收和利用无机碳起着关键作用[17]。锰是藻类生长必不可少的一种微量元素,能活化糖酵解及三羧酸循环中的某些酶,参与光合作用,是叶绿体的重要结构成分。本研究表明适当的添加锌锰离子影响微拟球藻的生长、油脂积累和蛋白合成,所以在微拟球藻的生长过程中,适当的添加一定质量浓度具有胁迫作用的锌锰离子,是制约藻生长和物质积累的关键。

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LI Xia1,YU Shuijian1,LIANG Rongrong1,WANG Ni2,GUAN Bin2
(1.Qingdao Langyatai Group Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China;2.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q178.53

0254-5071(2017)11-0105-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.023

2017-06-28

李 霞(1976-),女,高级工程师,本科,研究方向为生物发酵工程。