清气化痰丸的质量标准提高研究
2017-12-04魏学冰李若绮
倪 琳，魏学冰，李若绮
（甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070）
清气化痰丸的质量标准提高研究
倪 琳，魏学冰，李若绮
（甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070）
目的 提高清气化痰丸的质量标准。方法 采用薄层色谱法（TLC）对制剂中半夏、陈皮、茯苓、苦杏仁进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中橙皮苷、黄芩苷和苦杏仁苷的含量，色谱柱：CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.4%磷酸（B）溶液为流动相梯度洗脱，流速 1.0 ml/min，检测波长 222 nm，柱温 30℃，进样量为 10 μl。结果 半夏、陈皮、茯苓、苦杏仁的TLC图斑点清晰，分离度较好，阴性对照无干扰。橙皮苷、黄芩苷、苦杏仁苷检测质量控制线性范围分别为 10.68～53.40 μg/min（r=0.999 3），43.60～218.00 μg/min（r=0.999 9），23.02～115.10 μg/min（r=0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜1.00%，加样回收率分别为96.62%～103.42%（RSD=2.86%，n=6），95.58%～101.51%（RSD=2.03%，n=6），96.14%～102.72%（RSD=2.89%，n=6）。结论 该标准可用于清气化痰丸的质量控制。
清气化痰丸；橙皮苷；黄芩苷；苦杏仁苷；质量标准
清气化痰丸由黄芩（酒炒）、瓜蒌仁霜、半夏（制）、陈皮、胆南星、生姜、苦杏仁、枳实、茯苓九味中药材组成，具有清肺化痰功效，临床上用于治疗肺热咳嗽，痰多黄稠、胸脘满闷等症[1]。该制剂现执行《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂（第七册）》中的标准，原标准仅有鉴别及常规检查项，不利于药品质量控制，为了更好地控制其质量，有必要对现行标准进行修订。本研究采用薄层色谱法（TLC）对制剂中半夏、陈皮、茯苓、苦杏仁四味药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对制剂中的主要有效成分橙皮苷、黄芩苷、苦杏仁苷进行定量分析，为提高其质量标准提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器
Waters Alliance e2695型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（Waters 2998）；KQ3200DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，200 W，40 kHz）；Mettler AE240电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。
1.2 药品与试剂
清气化痰丸（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：15C1-1、15J2-1、15J3-1，规格：每6丸相当于原生药3 g）。橙皮苷对照品（批号：110721-201316，纯度：93.3%），黄芩苷对照品（批号：110715-201318，纯度：93.3%），苦杏仁苷对照品（批号：110820-201508，纯度：93.4%），半夏对照药材（批号：121272-200401），陈皮对照药材（批号：120969-201109），枳实对照药材（批号：120936-201005），茯苓对照药材（批号：121090-201002），苦杏仁对照药材（批号：121554-200702）均购自中国食品药品检定研究院。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 半夏 取样品5 g，研细，加乙醇25 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇3 ml使溶解，作为供试品溶液。取半夏对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按清气化痰丸处方和工艺制备半夏的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2]试验，取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-丙酮- 甲酸（30∶60∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。
2.1.2 陈皮、枳实 取样品3 g，研细，加甲醇30 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取陈皮、枳实对照药材各1 g，分别同法制成对照药材溶液；再取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。按清气化痰丸处方和工艺制备陈皮、枳实的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2]试验，取上述4种溶液各3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇 - 水（40∶7∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。
2.1.3 茯苓 取样品5 g，研细，加乙醚50 ml，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取茯苓对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按清气化痰丸处方和工艺制备茯苓的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2]试验，取供试品溶液、阴性对照品溶液5 μl，对照药材溶液10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯 - 乙酸乙酯 - 甲酸（20∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液-乙醇（4∶1）混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。
2.1.4 苦杏仁 取样品5 g，研细，加甲醇50 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。取苦杏仁对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按清气化痰丸处方和工艺制备苦杏仁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按TLC法[2]试验，取供试品溶液、阴性对照品溶液5 μl、对照药材溶液10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 - 甲醇 - 水（15∶40∶22∶10）5～10℃放置 12 h 的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，立即用含0.8%磷钼酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（254 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。
2.2 橙皮苷、黄芩苷、苦杏仁苷的含量测定
2.2.1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱选用CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脱，0～10 min，A 为 15%，B为 85%；11～50 min，A 为25%，B为75%；51～80 min，A为15%，B为85%；检测波长为222 nm；柱温 30℃，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl。在上述色谱条件下，理论板数以苦杏仁苷峰、橙皮苷峰、黄芩苷峰计算均不低于4 000。供试品中的苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷与其他杂质峰均能很好地分离，分离度＞1.5。结果见图1～2。
图1 对照品高效液相色谱图
图2 供试品高效液相色谱图
2.2.2 混合对照品溶液的制备 取苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含苦杏仁苷对照品0.115 1 mg、橙皮苷对照品0.053 4 mg、黄芩苷对照品0.218 0 mg的混合溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取样品约1 g，研细，精密称定，精密加入甲醇100 ml，密塞，称定重量，加热回流3 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 标准曲线的制备 精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测定峰面积积分值，以对照品质量浓度（x，μg/ml）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标（y）进行线性回归，分别得到回归方程：苦杏仁苷y=9.759 0×105x+2.820 3×104（r=0.999 9），橙皮苷y=1.855 4×106x+7.760 8×104（r=0.999 3），黄芩苷y=3.706 7×106x-6.931 6×104（r=0.999 6）。结果表明，苦杏仁苷在23.02～115.10 μg/ml范围内、橙皮苷在 10.68～53.40 μg/ml范围内、黄芩苷在43.62～218.00 μg/ml范围内均呈良好的线性关系。
2.2.5 专属性试验 按处方比例及制备工艺，配制不含黄芩、陈皮、枳实、苦杏仁的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果本品在苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷混合对照品相应位置处无色谱峰出现，说明本品阴性无干扰。结果见图3。
图3 阴性对照高效液相色谱图
2.2.6 仪器精密度试验 取清气化痰丸（批号：15C1-1），按“2.2.3”项下方法提取，重复进样6次，结果苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为1.29%、0.44%、0.23%，表明仪器精密度良好。
2.2.7 重复性试验 取清气化痰丸（批号：15C1-1），按“2.2.3”项下方法提取供试品6份，测定苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷RSD分别为0.39%、1.22%、0.60%。
2.2.8 加样回收率试验 采用加样回收法，精密称取已知苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷含量的供试品（批号：15C1-1）6份，每份约0.12 g，精密称定，分别精密加入一定量的混合对照品溶液（苦杏仁苷0.107 5 mg/ml、橙皮苷0.051 8 mg/ml、黄芩苷0.107 4 mg/ml），用氮吹仪将溶媒吹干，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定供试品中苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷的含量，计算回收率，结果见表1。
表1 加样回收率试验结果（n=6）
2.2.9 稳定性试验 取“2.2.7”项下样品，分别在 0、5、10、15、20、25、32 h测定峰面积，苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷峰面积稳定，RSD分别为0.95%、0.44%、1.12%，表明供试品溶液在室温下放置32 h内基本稳定。
2.2.10 样品的测定 取清气化痰丸3批，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷的含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果（n=3）
3 讨论
3.1 不同溶媒及提取方法的比较
分别以甲醇加热回流3 h、70%乙醇回流3 h、甲醇超声3 h提取样品（批号：15C1-1）中黄芩苷、橙皮苷的含量[3]，结果：甲醇加热回流3 h，黄芩苷6.052 mg/g、橙皮苷0.763 mg/g、苦杏仁苷0.772 mg/g）；70%乙醇回流3 h，黄芩苷13.892 mg/g、橙皮苷2.064 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；甲醇超声3 h，黄芩苷0.064 mg/g、橙皮苷1.432 mg/g、苦杏仁苷0.672 mg/g。故以70%乙醇作为溶媒提取样品，黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量较高。
3.2 考察以70%乙醇作为溶媒，不同提取时间的比较
分别以70%乙醇回流2 h、70%乙醇回流3 h、70%乙醇回流4 h提取样品（批号：15C1-1）中黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量，结果：70%乙醇回流2 h，黄芩苷5.022 mg/g、橙皮苷1.221 mg/g、、苦杏仁苷1.002 mg/g；70%乙醇回流3 h，黄芩苷13.894 mg/g、橙皮苷2.062 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；70%乙醇回流4 h，黄芩苷 5.072 mg/g、橙皮苷 2.273 mg/g、苦杏仁苷 1.013 mg/g。由结果看出，70%乙醇回流4 h，橙皮苷的含量较回流3 h高，但黄芩苷的含量不到回流3 h的1/2，故选取以70%乙醇回流提取3 h。
3.3 检测波长的选择
在200～400 nm处分别测定黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的最大吸收波长，测得黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷均在222 nm处有最大吸收，故选择在222 nm处同时测定样品中黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量[4～6]。
3.4 耐用性考察
本研究比较了不同类型的色谱柱（Agilent Zorbax SB C18、Waters SunFire C18、CAPCELL PAK C18），不同生产厂家（Waters、Agilent、岛津公司）的仪器，不同柱温（25℃、30℃、35℃、40℃）以及不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）的影响，均得到满意结果，说明该方法耐用性良好。
3.5 流动相的选择
对流动相的使用起初参考相关文献提出的甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）[7]，由于甲醇在 205 nm处存在末端吸收，故使用乙腈作为流动相。参考相关文献[8～11]，采用乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脱，黄芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷峰分离度较好、基线噪音小。经方法学验证，该方法线性、精密度、重复性、稳定性、准确度、耐用性均符合要求，可作为清气化痰丸质量控制的方法。
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R284
A
1671-1246（2017）23-0081-03
