纳米材料钼对大豆子叶节诱导的影响

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纳米材料钼对大豆子叶节诱导的影响

张华雪1，张炜坤1，赵恢1，张小芳1，东方阳1，李桂兰1
(河北科技师范学院生命科技学院， 河北 昌黎 066600)

为提高大豆子叶节转化效率，以豫豆22为试验材料，研究不同浓度(0，20，40，60 mol/L)纳米材料钼(Mo)对大豆子叶节的影响。结果表明，纳米材料钼对出芽、抽茎和生根都有促进作用，在0～40 mol/L范围内随着浓度的升高逐渐增加，40 mol/L时达到最大值，出芽率、抽茎率和生根率分别比对照提高了13.54%、13.18%和11.96%；在60 mol/L时，3项指标均下降，出芽率仍显著高于对照，抽茎率降至与对照无显著差异，生根受到抑制，生根率下降了4.76%，显著低于对照。因此，在0～40 mol/L浓度范围内，向培养基中添加纳米材料钼可以提高大豆子叶节的诱导效果。

纳米材料； 钼； 大豆子叶节

大豆(Glycinemax(L.)Merr.)起源并驯化于我国，是重要的经济作物和油料作物[1]。目前，通过基因工程改良大豆的品质是重要的育种手段[2-3]。大豆子叶节转化法是获得转基因大豆的重要方法之一，但大豆在全球范围内被认为是一种转化效率极低的农作物[4-5]，有报道其子叶节转化效率大概在0.03%～6%之间[6]。大豆子叶节转化率低有2个主要原因，第1个是子叶节分化的速率比较低，第2个则是难以伸长[7]，因此，如何提高大豆子叶节分化的速率是提高转化效率的必要条件之一。

纳米材料是指特征尺寸在1～100 nm之间的极细颗粒组成的固体材料。作为一种新型材料，纳米材料已被广泛应用在电子学领域、光学领域、化工领域等。目前，纳米材料已逐步应用到生命科学领域中，有研究结果显示，纳米材料在一定浓度下，具有促进种子萌发和植物生长发育的作用，但随着纳米材料浓度的不断增加，对植物生长则出现抑制作用[8]。关于这类报告，目前国内外已有众多相关研究结果[9-13]。钼是植物体内固氮菌中钼黄素蛋白酶的主要成分之一，也是植物硝酸还原酶的主要成分之一，还能激发磷酸酶活性，促进作物内糖和淀粉的合成与输送，有利于作物早熟。关于纳米材料钼对植物的生长发育的影响在国内的报道很少。本研究以种植广泛的大豆品种豫豆22为试验材料，通过在大豆子叶节不定芽诱导时添加不同浓度的纳米材料钼，研究纳米材料钼对大豆子叶节出芽、抽茎以及生根的影响，以期明确大豆子叶节分化，伸长时所使用纳米材料钼的最佳浓度，为提高大豆子叶节转化提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 材 料

豫豆22大豆种子(河南省农科院提供)；纳米材料钼(OD为50 nm，购自于北京德科岛金)。

1.1.2 培养基

采用B 5为大豆组织培养的基本培养基。

1) 种子萌发培养基：B 5基本培养基+0.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂，pH=5.8。

2) 芽诱导培养基：B 5基本培养基+0 mg/L纳米钼/20 mg/L纳米钼/40 mg/L纳米钼/60 mg/L 纳米钼+1.7 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂，pH=5.8。

1.2 实验方法

1.2.1 种子的灭菌与无菌苗的获得

选取种皮完整无病斑虫害，色泽光亮且饱满的成熟大豆种子作为试验材料，用氯气熏蒸法进行消毒：首先将挑选的大豆种子放置到干燥的培养皿中，培养皿不加盖，然后将装有大豆种子的培养皿放入到干燥的容器内，在干燥容器内放入装有100 mL次氯酸钠的小烧杯，沿烧杯壁缓慢加入10 mL浓盐酸,迅速盖上干燥容器盖，整个操作过程在通风厨中进行，灭菌12～16 h。将消完毒的种子接种到事先灭好菌的种子萌发培养基中，放到培养室内进行培养4～5 d。培养室温度控制在22～24 ℃，昼夜光照时间为16 h/8 h。

1.2.2 子叶节的获得和再生培养

大豆在萌发培养基中培养4～5 d后，选择生长健壮，无病菌、无污染刚刚萌发变绿的大豆，剥净大豆种皮，用解剖刀沿纵向线切开，切除胚根以及腋芽，保留子叶和3～5 mm的上胚轴，获得大豆子叶节。将获得的大豆子叶节接种到添加不同浓度纳米钼的芽诱导培养基中培养，此过程必须在无菌环境下进行操作，防止子叶节被污染，生长所需温度为22～24 ℃。

1.3 统计数据

从子叶节接种到芽诱导培养基之日起，每隔5 d记录发芽数、抽茎数和生根数。统计大豆子叶节的出芽率、抽茎率、生根率。

出芽率(%)=总发芽数/总外植体数×100%；

抽茎率(%)=总抽茎数/总外植体数×100%；

生根率(%)=总生根数/总外植体数×100%。

试验数据运用SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

试验结果表明，向培养基中添加纳米钼对大豆子叶节的出芽率、抽茎率和生根率都有影响。

2.1 不同浓度纳米钼对大豆子叶节出芽率的影响

芽诱导培养基中纳米钼浓度在20，40 mg/L和60 mg/L时，对大豆子叶节的出芽率都有提高作用，分别比对照提高了13.4%、17.7%和12.7%，均达到显著差异水平。其促进作用趋势从20 mol/L到40 mol/L逐渐增加，40 mol/L到60 mol/L有所减少。当芽诱导培养基中纳米钼的浓度为40 mg/L时，大豆子叶节的出芽率为89.87%，达到最高，与对照的差异极显著。说明在芽诱导培养基中加入适量的纳米钼有利于提高大豆子叶节的出芽，40 mol/L为最佳浓度(表1)。

表1 不同浓度纳米钼对大豆子叶节出芽率的影响

浓度(mg/L)出芽率(%)差异显著性;5%;1%ck76．33±1．42cB2086．59±1．92bAB4089．87±2．68aA6086．05±1．68bB

大豆子叶节在添加不同浓度纳米钼的芽诱导培养基中，尤其是前期，子叶节的出芽率比较快(图1)。大豆子叶节的出芽率在处理前30 d中每隔5 d相比之前增加5%～10%，且增加速率平稳，30 d时出芽率达到最高峰，30～35 d时，各处理之间出芽率基本趋于稳定。在整个子叶节培养过程中，20，40 mg/L和60 mg/L 3种浓度纳米钼处理液对大豆子叶节的出芽率平均效果高于对照组，20 mg/L和60 mg/L纳米钼处理液对子叶节的出芽速率基本一致，40 mg/L纳米钼处理对大豆子叶节的出芽率明显高于各处理组。试验结果表明：添加一定浓度的纳米钼，可以促进大豆子叶节的出芽，提高出芽率，其中纳米钼的浓度为40 mg/L时，对大豆子叶节出芽率有显著提高作用。

图1 不同浓度纳米钼在不同时期对大豆子叶节出芽率的影响

2.2 不同浓度纳米钼对大豆子叶节抽茎率的影响

当培养基中纳米钼浓度为40 mg/L时，大豆子叶节的抽茎率为78.72%，与对照(65.54%)之间存在显著差异，且抽茎率高于对照组，20 mg/L和60 mg/L的纳米钼对子叶节的抽茎率均与对照之间无显著差异(表2)。试验结果说明，当芽诱导培养基中纳米钼的浓度为20 mg/L和60 mg/L时，对大豆子叶节的抽茎无显著作用，40 mg/L时对大豆子叶节的抽茎有显著促进作用。

表2 不同浓度纳米钼对大豆子叶节抽茎率的影响

浓度(mg/L)抽茎率(%)差异显著性;5%;1%ck65．54±1．98bB2068．23±2．43bB4078．72±1．76aA6067．96±2．21bB

2.3 不同浓度纳米钼对大豆子叶节生根率的影响

20，40 mg/L和60 mg/L纳米钼处理的子叶节生根率与对照处理的子叶节生根率均存在显著差异(表3)。20 mg/L和40 mg/L纳米钼处理的子叶节的生根率均高于对照组处理，而60 mg/L纳米钼处理的子叶节的生根率小于对照组。试验结果表明，纳米钼的浓度在0～40 mg/L范围内，子叶节的生根率逐渐增大，即纳米钼的浓度在0～40 mg/L范围内，可以促进大豆子叶节生根；当纳米钼的浓度为60 mg/L时，子叶节的生根率低于对照组，即纳米钼的浓度达到60 mg/L时，对子叶节生根有抑制作用。

表3 不同浓度纳米钼对大豆子叶节生根率的影响

浓度(mg/L)生根率(%)差异显著性;5%;1%ck78．74±2．14bB2085．36±2．17aA4090．70±5．37aA6073．98±4．76cC

3 讨 论

目前关于纳米材料对植物生长的影响众说纷纭，正负效应以及无影响的结果均有报道[14]。近年来，国内外有研究表明，纳米材料在水稻、玉米、番茄、豌豆等作物的种子萌发及生长方面起到了促进作用[15-17]。其中对单壁碳纳米管研究表明，40 mg/L单壁碳纳米管可以促进大豆子叶节分化速率，并且生长势比对照组也有显著提高的效果；10～40 mg/L单壁碳纳米管对番茄的出芽率有显著提高的作用，但对黄瓜的生根却有抑制作用[18]。Mall[19]等发现纳米材料TiO2可以促进作物的伸长，对作物的产量有显著提高，郭莉等[20]发现，在一定浓度范围内,纳米TiO2对豌豆萌发及幼苗生长起促进作用,表现出了较高的生物活性，当超出浓度范围时，纳米TiO2对豌豆萌发及幼苗生长具有明显的抑制作用。本试验主要针对纳米钼对大豆子叶节诱导的影响进行研究，研究结果也显示出不同浓度对大豆子叶节出芽、抽茎和生根或促进或抑制，作用不等，且在纳米钼的浓度达到40 mol/L时的促进效果最佳，与其他处理间差异显著。综合研究发现，纳米材料在大豆遗传转化方面的应用是一项完全不同于传统措施的新技术，而且影响植株遗传转化与不同纳米材料的形态特征、浓度和植株本身特性都有一定关系。

4 结 论

本试验以豫豆22为材料，研究不同浓度纳米钼对大豆子叶节发芽率、抽茎率和生根率的影响。在芽诱导培养基中添加一定浓度的纳米钼对大豆子叶节的出芽率、抽茎率和生根率都有不同程度的提高，在纳米钼浓度为40 mol/L时均达到最佳水平。

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Effect of Nano Materials Molybdenum on Induction of Soybean Cotyledonary Node

ZHANGHuaxue1，ZHANGWeikun1，ZHAOHui1，ZHANGXiaofang1，DONGFangyang1，LIGuilan1
(Life Science and Technology College,Hebei Normal University of Technology,Changli Hebei 066600，China)

To improve the transformation efficiency of soybean cotyledonary node,different concentration nano materials of molybdenum(Mo) were conducted to study the effects of soybean cotyledonary node of Yudou 22.The results show that the nano materials of molybdenum have a promoting effect on budding,pumping stems and rooting which gradually increased with the increase of concentration during 0-40 mol/L,and the 40 mol/L of concentration reached the maximum,the budding rate,pumping stems rate and rooting rate improve by 13.54%,13.18% and 11.96% respectively.The three index have declined at 60 mol/L,budding rate was significantly higher than control,pumping stems rate dropped to no significant differences compared with control,root was restrained,rooting rate dropped by 4.76% and significantly lower than control.Therefore,adding nano materials of molybdenum at 0-40 mol/L into the culture medium can improve the induction effect of soybean cotyledon node.

nano materials； molybdenum(Mo)； soybean cotyledonary node

2017-01-09

转基因生物新品种培育科技重大专项(2014 ZX 0800404 B)；河北省自然科学基金项目(C 2014407051；C 2016407100)。

张华雪(1990—)，女，内蒙古呼伦贝尔市人；硕士研究生，研究方向：遗传学；E-mail:191798470@qq.com。

东方阳，男，博士，教授，研究方向：分子遗传；E-mail:yang_dongfang@hotmail.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.045

S 565.1

A

1001-4705(2017)07-0045-04