SSR标记检验玉米杂交种子纯度核心引物的构建

朱盛安，李 璐，孔祥云，段广新，田景翠，史淑新，齐冰玉

（新乡市种子管理站，河南 新乡 453000）

SSR标记检验玉米杂交种子纯度核心引物的构建

朱盛安，李 璐，孔祥云，段广新，田景翠，史淑新，齐冰玉

（新乡市种子管理站，河南 新乡 453000）

利用50对SSR引物对收集到的18个玉米杂交种及其亲本进行SSR标记分析，以期筛选一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物。试验结果表明，50对SSR引物在18个杂交种及其亲本中，有20对引物扩增出多态性特异条带，进一步对20对引物进行重复试验和PCR反应条件的优化，筛选出了8对SSR标记引物，分别在18个玉米杂交种及其亲本中扩增到了条带清晰、多态性好的条带，可用于其玉米杂交种子纯度鉴定和检验。这为玉米杂交种种子真实性和纯度检验、解决玉米种子质量纠纷提供了更为准确可靠的参考依据。

玉米；杂交种；SSR；纯度鉴定；核心引物

玉米品种纯度鉴定对玉米种子质量管理具有重要意义。随着玉米品种鉴定技术的发展，分子标记技术已经开始在玉米品种纯度鉴定中得到应用，其中SSR标记因其重复性好、多态性好、共显性、数据资源丰富等优点，成为目前在种子纯度检验当中应用较多的标记技术。然而，在以往的研究中，为解决少数杂交种的纯度鉴定，往往需要进行大量的引物筛选工作，才能找到适合的鉴定引物。李晓辉等（2003）从220对SSR引物中筛选出58对引物进行13个玉米杂交种的纯度鉴定；高文伟等（2004）利用50对引物筛选两个玉米杂交种农大108和豫玉27的纯度鉴定引物；吴永升等（2006）利用10个SSR引物筛选一个玉米杂交种桂单22号的纯度鉴定引物。这些研究在利用分子标记进行玉米杂交种纯度鉴定方面进行了一些有益的探索，然而，前期筛选工作量大，且仅限于少数杂交种的纯度鉴定。能否确定一套适于纯度鉴定的SSR核心引物，对已知品种的纯度鉴定，就不再需要进行烦琐的引物筛选，即使对未知品种，也只需进行少量的筛选，就能迅速找到合适的鉴定引物，从而为解决玉米品种纯度鉴定搭建技术平台，加快SSR技术在玉米纯度鉴定上的推广应用。

本研究旨在通过利用50对SSR引物，对18个新乡地区主要推广的玉米杂交种进行SSR标记分析，确定一套适合于这些玉米杂交种纯度鉴定的核心引物以及确定特定品种的纯度鉴定的特异引物，进而为SSR标记在玉米杂交种子纯度检验鉴定中应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为新乡市种子管理站收集到的，包括向各育种单位直接征集的18个玉米杂交种及其亲本，如表1所示。这些品种基本上能够代表目前新乡市玉米新品种的情况。

表1 18个玉米杂交种及其亲本

1.2 SSR引物

查阅相关文献和MaizeGDB等数据库，挑选在自交系中扩增出1条谱带、自交系间多态性好（2条谱带以上）、谱带清晰的50对SSR标记的引物，将引物名称和序列发给郑州市久是生物技术公司进行合成。

1.3 DNA提取

用收集到的种子为试验材料，采用CTAB法试剂盒进行DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.4 SSR扩增

应体体系：10μL反应液中包括：10mmol/L Tris-HCI，50mmol/L KCl，0.001 %Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16 mmol/L dNTP，0.25μmol/L SSR 引物，1U Taq DNA聚合酶，2μLDNA模板。这些试剂由郑州市久是生物技术公司提供。

反应程序：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性40 S，60℃退火35 S，72℃延伸45 S，共35个循环。PCR扩 增 在 PTC-100 PCR仪 (MJ Research，Watertown，MA)上进行。

1.5 电泳检测

PCR反应产物变性后在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。预电泳85w，20min；电泳80w，40 min。银染：10%冰醋酸固定3min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10S；0.2%AgN03溶液染色5 min；显影液3%NaOH+0.5%甲醛显影；10%冰醋酸定影。电泳结果放在背光灯下进行谱代分析。

2 结果分析

2.1 提取的样品DNA检测

以收集到的种子为试验材料，采用CTAB法试剂盒进行DNA提取，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测结果如图1所示。由图1可知DNA条带清晰，较为集中，拖尾不明显，没有降解。

图1 提取的部分DNA琼脂糖电泳检测结果

2.2 适于纯度鉴定用引物的选择

利用在文献中筛选的50对SSR标记对18个玉米杂交种及其亲本自交系进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物的多态性分离，进行SSR引物的筛选。共筛选到20对SSR引物在所有试验材料中有多态性的谱带，并且条带较为清晰。

引物umc1176在试验材料（含杂交种）中电泳结果如图2所示。

图2 引物umc1176在试验材料（含杂交种）中的电泳结果

2.3 纯度鉴定特异引物的确定

遵循条带清晰、非特异扩增条带少或没有，在自交系亲本中有差异，相应的玉米杂交种中有互补型条带等原则，从筛选到的20对SSR引物中，利用杂交种和亲本进行重复扩增检测。引物phi072k4在浚单26及其亲本材料中的检测结果如图3所示。

图3 phi072k4在浚单26及其亲本材料中的检测结果

根据多次重复的试验结果，最终决选出重复性好的8对SSR引物，构建成SSR标记检测玉米杂交种种子纯度的特异引物，引物名称、适宜检测品种、引物序列如表3所示。

表3 检测玉米品种纯度的特异引物

3 结论

玉米杂交种纯度鉴定有两个目的：一是验自交苗，也是最主要的目的，仅需要1对双亲互补型引物就可以；二是验异型株，需要用特异引物或引物组合，使得出现相同带型品种的概率足够低，从而能有效地区分出异型株。

基于这两点，适于纯度鉴定的核心引物必须具备以下两个特征：一是杂合率高，从而具有较强的区分自交苗的能力，能够比较容易筛选到双亲互补型的引物；二是多态性高，从而具有较高的区分异型株的能力。只有这样，才能保证预筛时仅采用少数引物就可以比较容易找到符合要求的引物。本试验在筛选SSR引物时，参照以上两点，参考了相关文献的做法。

由于玉米品种数量很大，要找到所有品种的特异引物是不可能的。确定纯度鉴定的特异引物，其意义在于，对于特定品种，不需要多个引物的组合，而仅需一个引物就可以同时检验自交株和异型株，从而大大减少纯度鉴定的成本（王文洁，2011；孟庆长，2009）。核心引物是用于筛选品种纯度鉴定用特异引物的首选引物，但对每个特定品种的纯度鉴定，根据检测实践进行多次重复筛选。并且要满足：一是具有双亲互补带型；二是基因型频率足够低，在特定品种范围内，该基因型具有相对唯一性。本试验中针对新乡目前推广的18个主要玉米杂交种筛选到了8对具有特异性的SSR引物，可用于这些的杂交种的真实性和纯度鉴定，这为新乡市种子管理站玉米杂交种种子真实性和纯度检验、解决玉米种子质量纠纷提供了更为准确可靠的参考依据。

[1] 李晓辉，李新海，李文华，等. SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用[J]. 作物学报，2003（29）：63-68.

[2] 高文伟，李晓辉，李新海. 玉米单粒和单叶片DNA快速提取及SSR标记分析[J]. 玉米科学，2004（12）：111-113.

[3] 吴永升，谭华，杨晓杰，等. 利用 SSR标记鉴定桂单 22号杂交一代种子纯度的研究[J]. 种子，2006（25）：28-30.

[4] 闫米格，骈跃斌，李素玲，等. 应用SSR标记技术进行引物筛选及玉米杂交种纯度的鉴定[J]. 吉林农业科学，2011（36）：9-12.

[5] 李素玲，柴美清，张君捷，等. SSR标记技术在玉米品种纯度鉴定上的利用研究[J]. 山西农业大学学报（自然科学版），2007（27）：133-135.

[6] 王利锋，李会勇，唐保军，等. 利用表型和 SSR 标记分析河南省玉米地方品种的遗传多样性[J]. 中国农业科学，2009（42）：1136-1144.

[7] 兰琴英，陈泽辉，祝云芳，等. 优良玉米杂交种金玉818指纹图谱构建及其纯度鉴定[J]. 贵州农业科学，2015（43）：1-6.

[8] 王文洁，周联东，郭玉霞，等. 构建玉米新品种新科19指纹图谱的SSR引物筛选[J]. 湖北农业科学，2011（50）：3635-3636.

[9] 孟庆长，陈艳萍，杨兴华，等. 利用SSR技术鉴定苏玉20的纯度[J]. 江苏农业学报，2009（25）：508-512.

[10] 王安贵，陈泽辉，祝云芳，等. 基于SSR标记的杂交玉米金单999种子的纯度检验[J].贵州农业科学，2011（5）：12-14.

2017河南省秋季种子信息交流暨产品展览会在郑州召开

本刊讯：2017年10月27日，由河南省种子协会主办的“2017河南省秋季种子信息交流暨产品展览会”在郑州国际会展中心成功举办。

被誉为“全国种业发展的风向标”的河南种子会，历经20多届的积淀，已经成为种子行业全国最大的盛会。展会以“规模大、品种全、效果好、人气旺”而饮誉种业界，影响力覆盖全国，成为国内种业企业、农资经销商、种植大户、政府主管机构、专家学者、行业协会等相关人士齐聚的盛会。本届展会采取河南省秋季种子信息交流暨产品展览会和河南省农药信息交流暨农药（械）交易会联合办展，河南种业、河南植保成果集中展示，参展企业数量、展示品种、专业观众再创新高，规模达到了历届展会之最。

《种业导刊》编辑部作为特邀代表全程参加了种子信息交流暨产品展览、种业高峰论坛等活动的宣传与报道，并在展会上进行《种业导刊》的宣传与展示，受到与会代表的欢迎。图为2017河南省秋季种子信息交流暨产品展览会开幕式。

Construction of Core Primers for Testing Purity of Hybrid Maize Seeds by SSR Marker

ZHU Shengan, LI Lu, KONG Xiangyun, DUAN Guangxin, TIAN Jingcui, SHI Shuxin, Qi Bingyu
(Seed Management Station of Xin xiang City, Xinxiang 453003, China)

18 maize hybrids and their parents were analyzed by 50 pairs of SSR marker primers in order to screen a set of core SSR primers suitable for purity identif i cation of maize hybrids. The experimental results suggest that there are 20 pairs of primers amplif i ed polymorphic specif i c bands in 18 hybrids among 50 pairs of SSR primers. Further optimization experiments were repeated and PCR reaction conditions by 20 pairs of primers. There are 8 pairs of SSR primers respectively in 18 maize hybrids and amplified the clear and polymorphic bands. They can be used for the hybrid maize seed purity identif i cation and inspection. This will be a more accurate and reliable reference for the authenticity and purity test of Corn Single Cross seeds and the resolution of corn seed quality disputes.

maize; hybrid; SSR; testing purity; core primers

S339.3

A

1003-4749（2017）11-0020-05

2017-10-18

河南省新乡市科技创新平台建设项目（CP1501）

朱盛安(1978-)，男，河南新乡人，农艺师，主要从事种子质量检验工作。