粉碎程度对畜禽骨蛋白消化率及骨粉的氨氮含量影响

张崟，熊伟，夏虎，郭思亚，张婷，唐欢，黄伟明，彭海川（成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106）

粉碎程度对畜禽骨蛋白消化率及骨粉的氨氮含量影响

张崟，熊伟，夏虎，郭思亚，张婷，唐欢，黄伟明，彭海川（成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106）

为了分析骨粉的粉碎程度对其消化率及骨粉的氨氮含量的影响，本文以猪大骨为原料，经高压蒸煮酶辅助水解后粉碎，制得颗粒尺寸大于 150 μm、小于 37.4 μm，以及尺寸介于 150 μm～92.9 μm、92.9 μm～75 μm、75 μm～58.9 μm、58.9 μm～48.9 μm、48.9 μm～41.8 μm、41.8 μm～37.4 μm 的骨粉，并对其氨氮含量、脂肪及水分含量，蛋白质消化率，碎骨蛋白的形态及碎骨的外观结构进行分析，结果发现，所得碎骨中尺寸小于37.4 μm骨粉占83.2%。粉碎的骨粉随着颗粒尺寸减小，其中的脂肪含量增加，氨氮含量减小。粉碎骨粉中蛋白质的消化率随骨粉尺寸减小呈现增加趋势，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率显著（P＜0.05）高于其他尺寸骨粉。粉碎骨粉的电泳图显示，粉碎骨粉中低分子量蛋白含量呈增加趋势。骨粉的微观结构显示，粉碎骨粉的表面呈圆润光滑状态。

碎骨；超微粉碎；酶解；消化率

我国是肉类生产和消费大国，畜禽屠宰产生的骨副产物的产量较大[1]。畜禽骨中含有丰富的氨基酸和人体所需的微量元素及维生素等营养物质[1]，具有很高的利用价值。但是，由于畜禽骨的天然坚硬结构，导致其中的营养物质难以被人体及其他动物完全消化吸收[2]。尽管国内有采用高压蒸煮及美拉德反应制备骨素呈味物质、酶解制备骨素肽等对畜禽骨的利用研究[3]，但均不能对畜禽骨中营养物质完全利用[4]。这也成为制约畜禽骨被高附加值回收利用的技术瓶颈。

Wondra等研究了饲料颗粒大小对生猪吸收饲料中营养物质的效率，发现饲料颗粒越小，生猪利用饲料中营养物质的效率越高[5]。Mavromichalis等发现小麦粉碎程度是影响猪仔对饲粮转化率的关键[6]。此外，底物的粒径大小对酶水解蛋白时降解效果也有显著影响[8]。因此，骨粉的粉碎程度可能对其中营养物质的消化吸收有一定影响。但是，国内外对畜禽骨的粉碎程度与其中营养物质的消化吸收率的研究较少。为此，本文探讨了粉碎程度对畜禽骨蛋白消化率及骨粉的氨氮含量的影响。这不仅将为完全利用畜禽骨中的营养物质提供理论依据，而且有利于完善骨粉碎程度与其中营养物质的消化吸收理论。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜猪大骨：四川欣康绿食品有限公司；木瓜蛋白酶（酶活10万U/g）：南宁庞博生物有限公司；胃蛋白酶（300万 U/g）、胰蛋白酶（酶活 25万 U/g）：如吉生物有限公司；电泳试剂丙烯酰胺、三（羟甲基）氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250（均为电泳专用生化试剂BR级）：北京诺其雅盛生物科技有限公司；浓硫酸、CuSO4·5H2O、K2SO4：成都科龙化工试剂厂。

1.2 试验设备

标准分样筛：言锦丝网加工厂；LE104E/02分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；WP-UPT-20超纯水机：四川沃特尔水处理有限公司；FW-100高速粉碎机：北京中兴伟业有限公司；WG1822DN高压锅：浙江爱仕达电器股份有限公司；JMF-80胶体磨：郑州玉祥机械设备有限公司；KDN-102C半自动凯氏定氮仪、HYP-1008消化炉：上海纤检仪器有限公司；SXT-06索氏抽提仪：上海精密仪器仪表有限公司；PH2000型显微镜：凤凰光学控股有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 骨粉制备

新鲜猪骨制备骨粉方法参考文献[9]，略有修改。猪大骨剔除残留的肉和筋腱后剁成2 cm左右的碎骨，用高速粉碎机粉碎为骨泥。每次取200 g骨泥，加入4 000 mL水，在0.15 MPa、121℃高压蒸煮2 h。冷却至55℃时，加入55℃纯水定容至400 mL，然后加入1 073.9 U/g木瓜蛋白酶，55℃恒温震荡酶解2 h。

1.3.2 不同粒径骨粉制备

酶解猪骨经JMF-80两级胶体磨，在刻度5、15、25分别粉碎 5 min，收集流出液，经 100 目（150 μm）、160目（92.9 μm）、200 目（75 μm）、250 目（58.9 μm）、300 目（48.9 μm）、350 目（41.8 μm）、400 目（37.4 μm）分样筛过滤，收集过滤物。将截留的液体与分样筛一并在65℃恒温干燥6 h，冷却后称量，计算截留率。计算式为：截留率/%=筛上骨粉质量（g）/回收骨粉总量（g）×100

1.3.3 骨粉的粗脂肪及水分含量测定

采用国标GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测骨粉的粗脂肪含量，国标GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》中干燥法测骨粉的水分含量。

1.3.4 骨粉的氨氮含量测定

采用半自动微量凯氏定氮法测定不同细度骨粉的蛋白质含量。准确称量1 g不同细度骨粉至消化管中，每管分别加入0.2 g CuSO4·5H2O和6.0 g K2SO4，然后加入 20 mL 浓硫酸后，在（200±2）℃消化 2.5 h，再在（420±2）℃继续消化6 h，待溶液消煮至清澈蓝绿色后定容，取10 mL消化液用半自动定氮仪测定溶液中的氨氮含量。

1.3.5 骨粉蛋白体外模拟消化分析

模拟消化分析方法见参考文献[10]，略有改动。向锥形瓶中准确称量（0.500 0±0.000 2）g不同细度的骨粉。量取新鲜浓盐酸4.2 mL用超纯水定溶到500 mL，调节pH值至1.5，加入0.75 g胃蛋白酶混匀。在锥形瓶中加入模拟胃液50.0 mL，在37℃震荡消化2 h。之后用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.2终止反应。

分别量取2 mL模拟肠液[（0.750 0±0.000 2）g胰蛋白酶溶于含有0.005 mol/L NaN3的20 mL pH 8.2的磷酸盐缓冲液]，加入到上述反应液中，在37℃恒温水浴震荡酶解2 h。酶解后加入10 mL 20%TCA溶液终止反应，静置2 h。用中性滤纸过滤消化液，采用半自动微量凯氏定氮法测定滤液中蛋白质含量。计算消化率公式为：消化率/%=TCA可溶性蛋白（g）/骨粉的总蛋白（g）×100。

1.3.6 凝胶电泳分析

骨粉蛋白电泳方法参考文献[3]，略有改动。分别称取不同细度骨粉2 g，加入18 mL 5%的SDS溶液。在95℃的水浴中加热1 h后，在20℃、11 000 r/min离心5 min，取上清液重复离心两次。取200 μL上清液加入 200 μL SDS-PAGE样品溶解液（0.5 mol/L的Tris-HCl，pH6.8，含 4 g/100 mL 的 SDS，20 g/100 mL 甘油和10 g/100 mL的β-巯基乙醇）混合煮沸3 min。采用5%浓缩胶、15%分离胶，在30 mA恒定电流下电泳，用考马斯亮蓝R-250染色液。

1.3.7 骨粉微观结构分析

将骨粉置于载玻片上，采用PH2000型生物显微镜，对不同尺寸的骨粉的表面结构进行观察。

1.3.8 数据处理

每样至少做3次平行试验，所得数据采用SAS 9.0中的Fisher法对其显著性进行分析，采用Excel2010对数据进行统计分析并绘图。

2 结果与讨论

2.1 骨粉粉碎后碎骨的尺寸分布

猪骨经高压蒸煮及酶辅助水解后粉碎，所得粉碎骨粉的尺寸分布见图1。

图1 粉碎后骨粉的尺寸分布Fig.1 Size distribution of ground bone meal

图1中数据显示，尺寸小于37.4 μm的骨粉总量显著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉，且截留率为83.2%，而尺寸大于37.4 μm的骨粉中，除了尺寸在41.8 μm～37.4 μm 的骨粉量显著（P＜0.05）低于大于 150 μm 和150 μm～92.9 μm的骨粉外，其他尺寸骨粉量间无显著（P＞0.05）差异，且随着截留尺寸减小呈下降趋势。这与文献[9]的研究结果一致。

猪骨经高压蒸煮后再酶辅助水解，可以使坚硬的猪骨出现微孔，这样有利于猪骨的进一步粉碎[9]。这可能是导致尺寸小于37.4 μm的骨粉总量显著高于其他尺寸骨粉的主要原因。尺寸大于37.4 μm的骨粉量随截留尺寸减小呈下降趋势，这可能是因为胶体磨内的死角，导致部分骨粉的粉碎程度不足，出现了极大和极小端高于中间段的极端分布现象。

2.2 水分含量和脂肪含量的变化

由于骨头中不仅含有蛋白质，还有脂肪和水分。为了明确粉碎骨粉中脂肪和水分残留量，对粉碎骨粉的水分和脂肪含量进行测定，结果见图2。

图2 粉碎骨粉的水分及脂肪含量Fig.2 Moisture and fat content of ground bone meal

图2中数据显示，粉碎骨粉中的脂肪含量随粉碎程度的增加呈显著（P＜0.05）增加趋势，尺寸小于37.4 μm和尺寸在41.8 μm～37.4 μm的骨粉的脂肪含量显著（P＜0.05）大于其他尺寸的骨粉。尺寸小于37.4 μm的骨粉的水分含量显著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉。

猪骨在蒸煮后，尽管已经通过去除蒸煮液上面的漂浮物去除了部分骨油，但难以全部除尽。随着猪骨的粉碎，骨粉的表面积增加，吸附能力增加，加之骨油易于流动。这些因素可能是导致骨粉的油脂含量随着骨粉尺寸减小呈显著增加的主要原因。小于37.4 μm的骨粉的水分含量显著高于其他尺寸的骨粉的可能原因是，小于37.4μm的骨粉较其他尺寸骨粉对水分和脂肪的吸附能力更强所致。

2.3 骨粉的氨氮含量

粉碎骨粉的氨氮含量结果见图3。

图3 粉碎骨粉的氨氮含量Fig.3 Total nitrogen content of ground bone meal

图3中数据显示，随着截留尺寸减小，骨粉中氨氮含量呈显著（P＜0.05）降低趋势。对骨粉的氨氮含量与其中的脂肪含量进行回归分析，两者呈二次相关性，其相关系数的平方为0.972 8。由此可见，粉碎骨粉中，脂肪含量较高，氨氮含量较低。

由于粉碎骨粉是骨头碎渣和脂肪的混合物，在通过目筛时，脂肪的流动性优于碎骨粉，所以更多的脂肪与碎骨粉一起通过目筛，并在较细的目筛上蓄积，因而导致较细骨粉的氨氮含量相对较少的。

2.4 骨粉蛋白质消化率

为了进一步分析粉碎程度对骨粉的营养成分的消化吸收影响，选择骨粉中的蛋白质作为指标，对其中的蛋白质的消化吸收率进行了分析，所得结果见图4。

图4 粉碎对骨粉的消化吸收影响Fig.4 Effect of grinding on the digestion and absorption of bone meal

图4中数据显示，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率显著（P＜0.05）高于尺寸在 41.8 μm～37.4 μm 的骨粉，尺寸在41.8 μm～37.4 μm骨粉的消化吸收率显著（P＜0.05）高于其他尺寸的骨粉。随着骨粉尺寸减小，骨粉中蛋白质的消化吸收率呈增加趋势。这与饲料颗粒大小与营养物质的吸收结果相符[5-6]。

猪骨经过蒸煮和酶辅助水解，加之胶体磨的粉碎，使其坚硬的天然结构被严重破坏。这使得骨粉中的蛋白质更多的裸露，易于受到蛋白酶的水解。此外，骨粉颗粒越小，其表面积越大，越有利于蛋白酶的水解。这些原因可能是导致尺寸小于37.4 μm和尺寸在41.8 μm～37.4 μm骨粉的消化吸收率显著高于其他尺寸骨粉的主要原因。

2.5 电泳结果

为了分析猪骨粉碎后其中的蛋白质形态变化，对粉碎骨粉进行SDS-PAGE分析，所得结果见图5。图5A为骨粉的电泳图，图5B为骨粉的电泳图O.D.值。

图5 粉碎对骨粉的蛋白质结构影响Fig.5 Effects of grinding on protein structure of bone meal

图5A显示，随着骨粉尺寸的减小，骨粉中小分子蛋白的量呈现增加趋势，这可以通过图5B中对电泳胶的O.D.值分析证实。

高压蒸煮和酶辅助水解，导致更多的骨胶原蛋白分解。这可能是出现图5中碎骨的低分子蛋白含量呈现增加趋势的原因。随着骨粉颗粒的减小，骨粉中小分子蛋白量增加。由此也进一步验证了2.4中，尺寸越小的骨粉中蛋白质的消化率越高的试验结果。

2.6 骨粉的微观结构

对粉碎骨粉的微观结构进行分析，所得结果见图6。

图6 骨粉的微观结构Fig.6 Microstructure of ground bone meal

图6中骨粉的结构显示，随着尺寸减小，骨粉颗粒越细，而且骨粉的表面结构呈现圆润光滑状态。

骨粉经过胶体磨粉碎过程中，需经过胶体磨磨盘的高速剪切和摩擦。这可能是导致粉碎骨粉的表面呈现光滑状态的原因。

3 结论

经高压蒸煮酶辅助水解后粉碎猪骨，所得碎骨中尺寸小于37.4 μm骨粉占83.2%。粉碎的骨粉随着颗粒尺寸减小，其中的脂肪含量增加，氨氮含量减小。粉碎骨粉中蛋白质的消化率随骨粉尺寸减小呈现增加趋势，尺寸小于37.4 μm骨粉的消化吸收率显著（P<0.05）高于其他尺寸骨粉。粉碎骨粉的电泳图显示，粉碎骨粉中低分子量蛋白含量呈增加趋势。骨粉的微观结构显示，粉碎骨粉的表面呈现圆润光滑状态。因此，微粉碎骨粉可以提高其中的低分子蛋白含量，促进微粉碎骨粉的消化吸收率。

[1]张婷,张崟,熊伟,等.畜禽骨微粉碎技术及其在食品中的应用[J].农产品加工,2016(11):52-53,56

[2]贾伟,董宪兵,张春晖,等.骨素美拉德反应罐的研制[J].化工机械,2013(6):822-824

[3]张崟,王新惠,王卫,等.骨素及骨素酶解液中蛋白质及肽的电泳分离[J].现代食品科技,2015(6):178-182

[4]张崟,王卫,张佳敏,等.骨素酶解工艺条件的响应面法优化[J].食品工业,2012(5):57-59

[5]Wondra K J,Hancock J D,Behnke K C,et al.Effects of particle size and pelleting on growth performance,nutrient digestibility,and stomach morphology in finishing pigs[J].Journal of animal science,1995,73(3):757-763

[6]Mavromichalis I,Hancock J D,Senne B W,et al.Enzyme supplementation and particle size of wheat in diets for nursery and finishing pigs[J].Journal of Animal Science,2001,78(12):3086-3095

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Effect of Grinding Degree on the Digestibility of Bone Protein and Ammonia Nitrogen Content of Bone Powder

ZHANG Yin，XIONG Wei，XIA Hu，GUO Si-ya，ZHANG Ting，TANG Huan，HUANG Wei-ming，PENG Hai-chuan
（Key Laboratory for Meat Processing of Sichuan Province，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

To analyze effect of grinding degree on the digestibility of bone protein and ammonia nitrogen content of bone powder，pig bone was taken as raw material，with the high pressure cooking and enzyme assisted hydrolysis，the bone was crushed with colloid mill into particle size larger than 150 μm，less than 37.4 μm，and sizerange of 150 μm-92.9 μm，92.9 μm-75 μm，75 μm-58.9 μm，58.9 μm-48.9 μm，48.9 μm-41.8 μm，41.8 μm-37.4 μm. Ammonia nitrogen content，fat and moisture contents，protein digestion ratio of bone meal were determined，and the protein pattern，bone morphology were analyzed. Results showed that the bone size smaller than 37.4 μm accounted for 83.2 %. With the decrease of particle size，the content of fat increased，and the content of ammonia nitrogen decreased. The digestion ratio of protein in the bone meal showed an increasing trend with the decrease of the size of the bone meal，and the digestion ratio of the bone size less than 37.4 μm was significantly（P＜0.05）higher than others. The result of SDS-PAGE of bone meal showed that the content of low molecular protein increased with the decrease of the size of the bone particle. The microstructure of bone meal showed that the surface of the crushed bone meal was smooth.

broken bone；ultrafine grinding；enzymatic hydrolysis；digestibility

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.017

四川省应用基础项目（2017JY0086）；四川省教育厅重点项目（17ZA0084）

张崟（1981—），男（汉），副教授，博士，主要从事畜产品加工与保藏研究。

2017-04-28