贵州优异白肉火龙果B 7的离体快繁技术研究

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(贵州大学a.农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室；b.生命科学学院， 贵阳 550025)

·种子生产·

贵州优异白肉火龙果B 7的离体快繁技术研究

刘小翠a,b，文晓鹏a，夏道强b，乔光a

(贵州大学a.农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室；b.生命科学学院， 贵阳 550025)

贵州优异白肉火龙果B 7具有较强的抗寒性，适宜在喀斯特地区推广种植。本研究以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、NAA、IAA、IBA、KT、ZT和TDZ，优化最佳增殖、生根培养基，建立并优化火龙果的离体快繁体系，为工厂化育苗奠定基础。结果表明：最优增殖培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均增殖系数为4.6，增殖苗健壮，长势好；最适生根培养基为MS+IBA 1.5 mg/L，根长势较好，平均生根系数为7.6；经炼苗移栽后，成活率达96%。

火龙果； 组织培养； 快速繁殖

火龙果(Hylocereusundatus)又名红龙果、仙蜜果、青龙果等，属仙人掌科量天尺属果用栽培种，原产于中美洲热带沙漠地区，具有耐热、耐旱等特点，外形独特，营养丰富，病虫害少，产量高，具有较高的营养价值、药用价值以及观赏价值[1-4]。贵州属南亚热带和中亚热带气候，在喀斯特高温干旱地区火龙果已成为新、特、优农业项目。作为贵州省“十二五”规划重点支持产业，火龙果已表现出巨大的经济、社会和生态效益。

表1 激素对火龙果茎段增殖的影响

处理号 细胞分裂素(mg/L) 生长素(mg/L) KTTDZZT6⁃BANAAIBA2，4⁃D增殖系数生长势12．00．13．4±0．3c生长良好，苗高1～3cm22．00．11．0±0．0h形成愈伤32．00．11．0±0．0h形成愈伤42．00．14．6±0．3a长势良好，苗高2～4cm50．11．2±0．1h长势较弱，苗高1～2cm60．50．11．6±0．2g长势较弱，苗高1～2cm71．00．12．6±0．4ef长势较弱，苗高1～3cm81．50．13．0±0．3d长势较好，苗高1～3cm92．50．14．0±0．4b长势较好，苗高2～4cm103．00．12．9±0．3de长势较弱，苗高1～3cm112．00．12．8±0．2def长势较好，苗高1～3cm122．00．12．5±0．4f长势较弱，有愈伤形成132．01．2±0．2h长势较弱，有愈伤形成142．00．21±0．0h长势弱，易褐化，无增殖

注：同一列中不同字母表示在0.05水平差异显著。下同。

有报道表明，火龙果幼芽、嫩茎及部分成熟枝条在气温低于5 ℃时易受冻，低温持续时间越长，对火龙果产量和品质影响越大[4]。近年来，由于气候异常，贵州省极端灾害天气持续时间呈上升趋势，低温严重影响火龙果的栽培及推广。贵州省果树研究所挖掘的优异白肉火龙果新种质B 7具较强的抗寒性[5]，在生产上有广阔的发展前景。采用传统的扦插或种子繁殖，速度较慢且受繁殖母株少的限制，很难满足大面积产业化发展的需求。本研究以贵州优异白肉火龙果种质B 7为试材，建立并优化离体快繁技术，实现工厂化育苗，以期为该种质的推广生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验以优异白肉火龙果B 7成熟胚为外植体，于2015年7月取自贵州省果树研究所火龙果资源圃。

1.2 方 法

1.2.1 无菌系的建立

选取大小均一、健康饱满的种子，流水下冲洗干净，用0.1%HgCl2消毒7～8 min，无菌水冲洗5次，蒸馏水浸种12 h后用无菌滤纸吸干表面水分，剥掉种皮接种在MS+GA32.0 mg/L培养基上，以此建立无菌系。

1.2.2 增殖培养基的筛选

增殖培养基共设14个处理(表1)，剪取2～3 cm无菌系幼嫩茎段作为外植体，接种在不同处理的培养基中。每处理接种5株，重复5次。组培苗培养条件为：温度(25±2)℃，光周期12 h/d，光照强度1 800～2 000 lx；30 d后观察生长情况，计算增殖系数。

1.2.3 生根培养基的筛选

将生长良好的增殖苗转入生根培养基中诱导生根，生根培养基为MS基本培养基附加不同浓度IBA(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L)，共6个处理。每处理接种5株，重复5次，30 d后统计生根情况。

1.2.4 移 栽

取生根情况均匀一致，根数3～4条，苗高2～3 cm的生根苗，通过7 d自然室温炼苗后，洗净根部培养基，移栽到灭菌的营养土里，封盖塑料薄膜保湿，7 d后去除薄膜，30 d后观察统计成活情况。

1.2.5 数据统计分析

增殖系数以萌发的腋芽数与原接种外植体数的比值表示，数据分析采用DPS数据分析软件进行，实验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用邓肯氏多重极差法在0.05水平进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 无菌系试管苗的建立

无菌系的建立是组织培养的基础，种子经12～15 min的表面灭菌，效果良好，7 d时统计污染率仅为5%。浸种能显著提高种子萌芽率，经12 h的浸种后，萌发率达90%(图1 A)。

2.2 激素对增殖的影响

激素的配比对火龙果试管苗的增殖有重要影响。从表1可知，处理1～4对增殖培养基中细胞分裂素的种类进行了筛选，结果发现，6-BA和KT都能很好地诱导外植体增殖，且长势良好，增殖系数分别为4.6±0.3和3.4±0.3，表明6-BA更有利于火龙果的增殖培养。添加了TDZ和ZT的培养基中外植体基本都形成了愈伤，没有增殖。

注：A为无菌系；B为增殖；C为生根；D为移栽。图1 贵州优异白肉火龙果B 7组培快繁体系

处理4～10对增殖培养基中6-BA浓度进行了筛选，结果表明，6-BA浓度在0～2.0 mg/L范围内时，组培苗增殖系数随浓度的增大而增加，在浓度为2.0 mg/L时，达到最大(4.6±0.3)，显著高于其他处理，且生长势较好，增殖苗健壮，苗高达2～4 cm。当6-BA浓度继续增大时，增殖系数随之降低。

处理4、11、12在确定最佳分裂素种类及浓度前提下，对生长素种类进行了筛选，结果发现，2，4-D的增殖系数最低(2.5±0.4)，其次是IBA(2.8±0.2)，且组培苗在这2种培养基中长势较弱，其中2,4-D还诱导形成了愈伤组织。而添加NAA的培养基中，其增殖系数高，生长状态好，说明NAA有利于白肉火龙果B 7的增殖。

处理4、13、14对最优增殖培养基中NAA浓度进行了筛选，结果发现，当NAA浓度为0 mg/L时，组培苗基本上没有生长，只是形成了一块白色的愈伤组织；当NAA浓度达0.2 mg/L时，组培苗出现了褐化现象，生长停滞，无增殖。当NAA浓度为0.1 mg/L时，增殖系数最高，生长情况最好，为最适增殖浓度。由此可得，处理4(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)为最佳增殖培养基(图1 B)。

2.3 激素对生根的影响

由图2可知，不同IBA浓度对白肉火龙果B 7组培苗生根的影响较大。当IBA浓度在0～2.5 mg/L范围内时，平均根数随浓度升高呈先增高后降低的趋势。当IBA浓度为1.5 mg/L时，组培苗生根效果最好，接种10 d左右即有根系发生，生根率达91%，30 d左右可产生2～4 cm根系，平均根数达7.6条(图1 C)，且小苗长势旺盛，苗壮，此时可出瓶移栽。当生根培养时间较长时，蔓茎上的分枝及气生根会增多。

2.4 试管苗的移栽

试管苗经过开瓶炼苗7 d后，移栽到灭菌的营养土中，移植后浇适量水并保持基质湿润。15 d左右幼苗恢复生长，30 d时统计移栽成活率达96%(图1-D)。

图2 生长素浓度对生根的影响

3 结论与讨论

2000年，贵州从海南引进火龙果种植，短短几年时间，贵州省火龙果产业规模已发展成为全国之首，在2013年底，罗甸火龙果获国家质检总局地理标志保护产品，成为全国第一个火龙果地理标志保护产品[6]。火龙果作为一个重要的经济产业，为贵州人民带来了巨大的经济效益。但近年贵州冬季低温持续时间较长，火龙果受冷害严重，极大限制了火龙果产业的发展。前期研究表明，贵州优异白肉火龙果B 7具有高耐寒性[5]，适宜贵州目前的气候条件。利用组织培养技术可快速繁殖该优异种质，为其大面积推广种植奠定基础。

获得无菌材料是建立无菌系的前提，消除外植体上的杂菌是离体培养的重要环节[7]。若以火龙果幼嫩茎段为外植体建立无菌系，污染率较高，这是由于火龙果茎上芽眼处着生丛刺，不易清洗，消毒剂也难以透入，无法彻底灭菌[8]。因此本研究选用成熟胚作为外植体建立无菌系。谢志亮等对白玉龙火龙果成熟种子无菌萌发技术进行了研究，结果表明，采用0.1%HgCl2消毒7～8 min，灭菌效果良好，几乎无污染，对种子萌发生长无不良反应[9]。郑思成等报道了火龙果种胚无菌快速催芽技术，从浸种时间、基本培养基及生长调节物质等方面进行了研究，结果发现，采用15%NaClO3灭菌12～15 min污染率低，浸种12 h，培养基中添加2.0 mg/L的GA3利于种胚萌发[10]。本研究综合了以上2种方法来建立无菌系，取得了较低的污染率和较高的萌发率，且无菌苗长势健壮。

在组织培养过程中，芽苗的发育受细胞分裂素与生长素的调控，2类激素在不定芽形成、细胞伸长及顶端优势等方面作用不同，只有当二者比例适当，才能互相协同作用，有利于不定芽的形成[8]。在进行培养基筛选时，应以较低的植物激素浓度，达到理想的繁殖系数为最优，这样可以避免由于过高的外源激素造成组培苗畸变、退化等现象，还可以节约成本[11]。本研究在增殖培养过程中筛选了最优细胞分裂素和生长素的种类及浓度，在供试的细胞分类素中，TDZ和ZT分裂能力明显较强于KT和6-BA，在2.0 mg/L时组培苗产生大量愈伤，无法增殖。相比于KT，6-BA更适合白肉火龙果B 7的增殖。从不同浓度6-BA对火龙果增殖的影响来看，较低或较高浓度都不能获得最大增殖系数，当浓度为2.0 mg/L时，获得的增殖系数最高，增殖苗健壮，长势好。在供试的生长素中，IBA和2,4-D均无法实现高频增殖，只有较低浓度的NAA(0.1 mg/L)可获得较高增殖系数。

关于火龙果组培快繁的研究，已有大量报道。彭绿春[11]等研究获得的最大增殖系数为6.4；黄文静等[12]得到最大增殖系数为4.9，最大生根数为6.8；刘洪章等[13]和刘颖等[14]获得的最大增殖系数为3.2，最大生根数为5.1；张领等[15]获得的最大增殖系数为12，最大生根数为7.2；杨红超等[16]研究得到最大增殖系数为3.5，最大生根数为7.2。利用本研究优化的最佳增殖培养基可获得最大增殖系数为4.6±0.3，最佳生根培养基可获得最多平均根数为7.6条。本试验通过对贵州优异白肉火龙果B 7的增殖及生根培养基的筛选，建立了高频离体快繁体系，得到最适增殖培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最适生根培养基为MS+IBA 1.5 mg/L。较之前人研究[12-16]，存在较大差异，其原因可能是火龙果品种差异、取材的生理状态不同以及试验设计的激素配比差异所导致[11]。

对植物而言，组织培养在某种程度上可以算作一种逆境胁迫，因此常常会发生体细胞无性系变异[17]。保持原有优良性状的火龙果组培苗对于该品种的推广生产非常重要。火龙果组培苗在经过离体快速增殖及长期继代培养后，极有可能发生变异。因此，对组培苗遗传稳定性的检测还需进一步研究。

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Studies on Tissue Culture and Rapid Propagation of Excellent White Pitaya B 7 in Guizhou

LIUXiaocuia,b，WENXiaopenga，XIADaoqiangb，QIAOGuanga

2016-08-26

国家自然基金(31401838)；贵州省重大专项资助项目(201260006-1)；贵州大学引进人才科研资助项目(2012018)。

刘小翠(1991—)，女，贵州遵义人；在读硕士研究生，研究方向：分子细胞生物学；E-mail:651078369@qq.com。

乔 光(1981—)，男，山西人；博士，研究方向：果树分子生物学；E-mail：13518504594@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.121

S 668.9

A

1001-4705(2017)01-0121-04