大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

黄谧+冯勇

摘要：根据大鲵虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV）主要衣壳蛋白（Major Capsid Protein，MCP）基因设计引物，PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp，将其克隆到原核表达载体pET-32a中，构建了重组原核表达载体pET-32a-MCP，并在大肠杆菌BL21中得到了表达，融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku，与预期大小一致，主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度，诱导温度等诱导表达条件进行优化，确定0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIV-MCP重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备了GSIV-MCP多克隆抗体，ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明，该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞（GICB）发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。

关键词：大鲵虹彩病毒；衣壳蛋白；原核表达；多克隆抗体；免疫检测

中图分类号：S947.3；Q786；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）21-4146-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.21.037

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the Major Capsid Protein of Chinese Giant Salamander Iridovirus

HUANG Mi1，2，FENG Yong1

（1.Wuhan University School of Basic Medical Science，Wuhan 430071，China；2.Hubei Genomics Institute，Wuhan 430075，China）

Abstract： According to major capsid protein（MCP） gene of chinese giant salamander iridovirus（GSIV），primers were designed，and MCP gene coding frame full-length sequence（1 392 bp in length） was amplified by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector pET-32a，to construct the recombinant expression vector pET-32a-MCP. The recombinant expression vector pET-32a-MCP was successfully expressed in E.coli BL21 as a fused recombinant protein with a size of 70 ku equal to the expected size， and presented mainly in inclusion body. The optimum induction condition for expression of the recombinant protein was 0.5 mmol/L IPTG，37 ℃，6 h. The purified recombinant proteins were used to immune New Zealand white rabbits to produce polyclonal antibody，the titers of polyclonal antibodies was above 1∶50 000 by ELISA. Western blot test demonstrated that the recombinant protein was recognized by the polyclonal antibody. An indirect immunofluorescent assay also showed that the polyclonal antibody was able to interact specifically with the pathological EPC cells（GICB） induced by GSIV infection. The conclusions made a preparations for the establishment of GSIV immunodiagnosis and the study of GSIV MCP gene coding protein functions.

Key words： Chinese giant salamander iridovirus（GSIV）； Capsid protein； prokaryotic expression； polyclonal antibodies； immunoassay

中國大鲵（Andrias davidianus）是现存个体体型最大的两栖动物，俗名娃娃鱼，是中国珍贵特产水生动物，属于国家二级保护动物，在中国部分地区成功实现了人工养殖。陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等省份的大鲵主养区近年暴发了大鲵病毒性出血病，该病可感染各种规格的养殖大鲵，死亡率高达90%以上，给大鲵养殖业造成了巨大的损失。

大鲵病毒性出血病的病原为大鲵虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV），是虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒属（Ranavirus）的成员[1-3]。虹彩病毒（Iridoviruses）是一类病毒粒子较大，呈二十面体状的双链DNA病毒[4]。虹彩病毒科（Iridoviridae）分为5个属——绿虹彩病毒属（Chloriridovirus）、虹彩病毒属（Iridovirus）、淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）、巨大细胞病毒属（Megalocytivirus）和蛙病毒属（Ranavirus）[5，6]。虹彩病毒可感染无脊椎动物（绿虹彩病毒属，虹彩病毒属）及变温脊椎动物（蛙病毒属，淋巴囊肿病毒属，巨大细胞病毒属），包括两栖类、爬行类、甲壳类、软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒，尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变温动物发病的一个重要原因[7，8]。endprint

主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）是虹彩病毒二十面体衣壳的主要结构蛋白，为一个单一的多肽，其分子量约为50 ku，占病毒总蛋白量的45%，占病毒可溶性蛋白的90%[9，10]。MCP基因在同属间具有高度的保守性，不同属间具有足够的差异性，是研究虹彩病毒分类及系统演变的靶基因。本研究将GSIV主要衣壳蛋白在大肠杆菌BL21中进行了融合表达，并将其纯化，制作多克隆抗体，为大鲵病毒性疾病的防治及GSIV的免疫检测试剂盒的研制奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、细胞系、菌株与质粒 大鲵虹彩病毒由武汉大学基础医学院实验室分离鉴定；鲤上皮瘤细胞系（Epithelioma papilloma cyprini，EPC）由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCCGDC0174；原核表达载体pET-32a、表达菌株BL21（DE3）購于Novagen公司；pMD19-T载体购于TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ（Promega），T4 DNA连接酶（TakaRa，T4 DNA Ligase），HRP标记的羊抗兔IgG（ABCLONAL BIOTECHNOLOGY，INC.），病毒DNA提取试剂盒（OMEGA，Viral DNA Kit），胶回收试剂盒（OMEGA，Gel Extraction Kit），质粒提取试剂盒（Promega，Pure YieldTM Plasmid Midiprep System），免疫荧光染色试剂盒（碧云天，免疫荧光染色试剂盒—抗兔Cy3），化学发光底物（Thermo，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）。

离心机（Sigma，3K-15），化学发光成像与分析系统（BiO-RAD，ChemiDocTM XRS+），PCR仪（Biometra，T-professional），低温恒温槽（上海恒平科学仪器有限公司），小型垂直电泳槽（BiO-RAD，Mini-PROTEAN？誖Tetra System），酶标仪（BiO-RAD，iMarkTM），半干转印槽（BiO-RAD，TRANS-BLOT？誖SD），倒置荧光显微镜（LEICA，DFC420C）。

1.1.3 引物 上游引物，5′-CGGAATTCATGTCTTCTG

TAACCG-3′含有EcoRⅠ酶切位点；下游引物，5′-CC

AAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3′含有HindⅢ酶切位点。

1.2 MCP基因的克隆

GSIV接种至EPC细胞，当细胞出现典型病变时，冻融病变细胞3次，将培养瓶中的悬浊液利用病毒DNA提取试剂盒抽提GSIV核酸，以抽提产物为模板，进行PCR扩增。采用50 μL反应体系，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Primers（F/R，10 μmol/L）各1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，DNA模板为0.5 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，经胶回收试剂盒回收目的片段，将纯化的的MCP基因与pMD19-T载体于16 ℃连接4 h后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，命名为pMD19-T-MCP，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 重组表达载体的构建

重组质粒pMD19-T-MCP与原核表达载体pET-32a分别由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，通过胶回收试剂盒回收目的片段，用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，PCR筛选阳性克隆，扩大培养后提取质粒，经酶切鉴定后，命名为pET-32a-MCP，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 重组蛋白的表达及表达形式的分析

将培养过夜的阳性重组菌pET-32a-MCP/BL21以1∶100的比例接种到LB液体培养基（含50 μg/mL Amp）中，37 ℃ 200 r/min振荡培养至菌液OD600 nm为0.4～0.6时，取2 mL菌液作为诱导菌的对照，然后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h后，取2 mL诱导菌液及上述对照菌液4 ℃ 5 000 g离心5 min收集菌体，用100 μL PBS重悬菌体，加入等量的SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中处理10 min，取10 μL进行SDS-PAGE分析。取诱导后的菌液进行超声破碎处理，4 ℃ 5 000 g离心5 min取上清及沉淀分别进行SDS-PAGE分析。

1.5 重组蛋白表达条件的优化及纯化

将培养过夜的阳性重组菌pET-32a-MCP/BL21以1∶100的比例接种到LB液体培养基（含50 μg/mL Amp）中，37 ℃ 200 r/min振荡培养至菌液OD600 nm为0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于加入IPTG的后的0、2、4、6、8 h分别取样，进行SDS-PAGE分析，以确定最佳诱导时间。在最佳诱导时间下，分别加入1.0、0.5、0.1、0 mmol/L的IPTG，以确定最佳的IPTG浓度。经过诱引的重组菌株经超声波破碎处理，离心去上清液，沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液（含8 mol/L尿素）中，然后参照蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化。

1.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测endprint

取纯化后的重组蛋白2 mL采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔 （免疫前采集正常血清作为阴性对照），以后每2周加强免疫1次，共4次。首次免疫加入与重组蛋白等量弗氏完全佐剂，后3次加入与重组蛋白等量弗氏不完全佐剂。末次加强免疫后7 d心脏采血，分离血清。抗血清经抗原亲和纯化得到纯化的多克隆抗体。用纯化的GSIV-MCP重组蛋白为抗原，以每孔100 μg的浓度4 ℃包被96孔板，待测多克隆抗体为一抗，按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000， 1∶512 000的比例稀释待测多抗，将注射佐剂加PBS的阴性血清以1∶1 000，1∶4 000稀释作为阴性对照。用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，以四甲基苯胺（TMB）溶液显色后用酶标仪测定OD450 nm，以确定抗体效价。将诱导表达的重组菌pET-32a-MCP/BL21進行进行SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用含有20g/L BSA的PBST（含有终浓度为0.05%的Tween-20）室温封闭1 h，用制备的GSIV-MCP抗体室温孵育1 h，PBST（含有终浓度为0.05%的Tween-20）洗膜后，用HRP标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，再次清洗，最后用化学发光底物工作液孵育5 min显色。同时用未经诱导表达的重组菌pET-32a-MCP/BL21作为对照进行相同操作。

1.7 间接荧光免疫检测GSIV

以纯化的GSIV-MCP多克隆抗体为一抗，红色荧光探针标记的羊抗兔IgG（H+L）抗体为二抗，参照免疫荧光染色试剂盒（碧云天，免疫荧光染色试剂盒-抗兔Cy3）对感染GSIV的EPC进行检测。同时用没有感染GSIV的EPC作为对照进行相同操作。

2 结果与分析

2.1 MCP基因的克隆

利用引物经PCR反应从抽提的病毒总DNA中扩增出目的片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析片段大小为1 400 bp，其分子量与预期大小一致，结果见图1。胶回收PCR产物，连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，获得了阳性重组菌株pMD19-T-MCP/DH5α，测序结果表明成功克隆了大小为1 392 bp的目的片段至T载体中。

2.2 重组表达载体的构建及鉴定

经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的pET-32a，与MCP基因连接后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，PCR鉴定获得了阳性重组菌株pET-32a-MCP/BL21。提取重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果表明双酶切得到的目的片段以及PCR鉴定阳性克隆的产物均与预期大小的核酸片段相同，结果见图2。测序结果进一步证明MCP基因被正确地插入到pET-32a载体上，成功构建了重组表达载体。

2.3 重组蛋白的表达及表达形式的分析

SDS-PAGE分析表明重组菌株pET-32a-MCP/ BL21经1 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下诱导4 h，能有效地诱导重组菌株的表达，蛋白分子质量约为70 ku，与预期大小一致。诱导表达的菌体通过超声破碎处理后，表达产物主要存在于超声破碎后的沉淀中，说明表达的蛋白主要以包涵体形式存在。结果见图3。

2.4 重组蛋白表达条件的优化及纯化

重组菌株pET-32a-MCP/BL21用1 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下分别诱导0、2、4、6、8 h，重组蛋白的表达量以诱导时间为6 h为最佳，结果见图4。以1.0、0.5、0.1、0 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下诱导6 h，以0.5 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白的表达量最大，结果见图5。因此初步确定重组菌株pET-32a-MCP/BL21融合表达重组蛋白的最佳条件为0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下诱导6 h。重组蛋白经蛋白纯化试剂盒的纯化得到了高纯度的可溶性蛋白质。结果见图6。经Bradford法测定并调整蛋白质的浓度为250 μg/mL。

2.5 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测

收集经过4次免疫的新西兰大白兔抗血清，抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体，浓度为3 mg/mL。经ELISA法测定，抗体效价大于1∶50 000。Western blot结果表明，GSIV-MCP多克隆抗体能特异性识别重组蛋白。结果见图7。

2.6 间接荧光免疫检测GSIV

间接荧光免疫结果显示，感染GSIV的EPC细胞在绿光激发下呈现出鲜光的红色，并且随着病毒感染时间的增加，红色荧光的强度增加；没有感染GSIV的EPC细胞则没有红色荧光出现。说明制备的GSIV-MCP多抗能够特异性地检测GSIV。结果见图8。

3 讨论

大鲵病毒性出血病是近年暴发的一种传染病，可感染各种规格的养殖大鲵，发病大鲵体表具有典型的出血症状，后肢肿大或溃疡，解剖发现内脏器官出血或坏死，其死亡率可达90%以上。大鲵病毒性出血病的病原为大鲵虹彩病毒。虹彩病毒是一类病毒粒子较大的胞浆型DNA病毒，是水生动物的一类主要病原。在中国已经从甲鱼[11]、云斑尖塘鳢[12]、条石鲷[13]、大口黑鲈[14，15]、虎纹蛙蝌蚪[16]等多种水生动物体内检测出虹彩病毒。

虹彩病毒的衣壳呈二十面体结构，由六面体状的衣壳亚单位构成。衣壳亚单位又称主要衣壳蛋白（Major capsid protein），其数量与病毒粒子的大小有关。MCP基因为虹彩病毒的一个晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表达，编码的主要衣壳蛋白分子量约为50 ku，构成病毒的二十面体衣壳[10，17]。比较虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列发现，虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列是高度保守的，同一属的同源性一般在90%以上，不同属之间的同源性一般为40%～50%[17]。endprint

本研究中将大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白（GSIV-MCP）基因克隆至原核表达载体pET-32a中进行了融合表达，表达的重组蛋白的分子量约70 ku。由于pET-32a原核表达载体，含有一段编码硫氧还蛋白的序列（编码109个氨基酸）、6个组氨酸标签序列及一个S标签序列（编码15个氨基酸）与目的蛋白融合表达，因此重组蛋白的分子量比目的蛋白大20.4 ku。目的基因与pET-32a融合表达这不仅提高了表达产物的稳定性，而且便于纯化和鉴定，同时又不影响目的蛋白的免疫原性。重组表达载体pET-32a-MCP经诱导条件的优化，在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。结果表明，0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。重组蛋白主要以包涵体形式存在，包涵体的形成便于重组蛋白的纯化。包涵体经磷酸钠缓冲液（含8 mol/L尿素）溶解、蛋白纯化试剂盒纯化得到了高纯度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清，抗血清经过抗体亲和纯化得到纯度较高的多克隆抗体。Western blot得到一条与预期大小一致蛋白杂交带，说明GSIV-MCP多克隆抗体特异性较好，纯度较高。间接荧光免疫结果表明，GSIV-MCP多克隆抗体能特异性的检测GSIV，说明制备的GSIV-MCP多克隆抗体能够满足GSIV免疫检测的要求。

将GSIV主要衣壳蛋白在大肠杆菌BL21中进行了融合表达，并将其纯化，制作多克隆抗体，这将为大鲵病毒性疾病的防治及GSIV的免疫检测试剂盒的研制奠定一定的基础。

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