PrepFiler Express BTATM裂解液联合硅珠法快速提取骨骼DNA

丁少成，张怀才，高林林

（杭州市公安局刑事科学技术研究所，浙江 杭州 310016）

·技术与应用·

PrepFiler Express BTATM裂解液联合硅珠法快速提取骨骼DNA

丁少成，张怀才，高林林

（杭州市公安局刑事科学技术研究所，浙江 杭州 310016）

目的建立方便、快捷的提取骨骼DNA的方法。方法对15份长骨样本清洗消毒后，采用电钻钻取骨屑，使用PrepFiler Express BTATM裂解液进行裂解消化后，应用手工硅珠吸附纯化进行DNA提取检验。结果有14份样本获得满意的STR分型，仅1份样本未获得STR分型，检出率为93.33%。结论本研究建立的骨骼DNA快速提取方法操作简单、便捷、有效，适应性强，值得推广应用。

法医遗传学；骨骼；DNA；PrepFiler Express BTATM；硅珠法

随着DNA技术的发展和实验室经验的积累，骨骼类生物检材DNA提取的方法已有多种多样[1]，高林林等[2]依托AutoMate ExpressTM系统，使用 PrepFiler Express BTATM试剂盒（以下简称BTA试剂盒），将骨骼DNA提取时间缩短到了3h内，大大提高了实验室的工作效率，为公安快速办案提供强有力的科技支撑。

笔者借鉴高林林等[2]建立的方法，采用电钻钻取骨屑，使用PrepFiler Express BTATM裂解液进行裂解消化，结合硅珠法纯化提取骨骼DNA，获得满意DNA分型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取日常检案中积累的高度腐败或者白骨化尸体骨骼样本15份（均为长骨），死亡时间长短不等，最长为30年左右，最短时间半年左右。

1.2 主要试剂和仪器

博世电钻（GSR120-Li，德国 BOSCH 公司）、Prep-Filer Express BTATM试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Lysis Buffer裂解液（德国 QIAGEN公司）、15%硅珠悬液、AmpFℓSTR®Identifiler®Plus试剂盒（美国 AB公司）；9700型 PCR仪（美国 AB公司）、3500xL基因分析仪（美国AB公司）等。

1.3 方法

1.3.1 样本准备与提取

所有样本均用刀将表面组织及污垢去除，清水清洗后晾干，置紫外灯下照射2h，用博世电钻在骨密质部位钻取骨屑。

每份样本取骨屑150mg左右于2mL样本管中，按照BTA试剂盒使用说明加入裂解缓冲液220 μL、蛋白酶 K（proteinase K，PK） 7 μL、1 mol二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 3μL（如裂解液不能完全浸没骨屑，可以按上述比例添加裂解液、PK和DTT至骨屑完全浸没于液体中）。56℃振荡消化2h，以离心半径5 cm，14 000 r/min，离心3 min，取上清液置于 1.5 mL离心管中，加入2倍体积Lysis Buffer裂解液、15%硅珠悬液30 μL，按硅珠法纯化提取模板DNA，洗脱体积为 30μL。

1.3.2 扩增与检测

采用AmpFℓSTR®Identifiler®Plus试剂盒在9700型PCR仪上进行复合扩增，PCR反应体系为10μL，其中模板DNA量为4 μL。反应条件：95℃ 11 min；94℃ 20 s，59℃ 3 min，29 个循环；60℃ 30 min，4℃保存。扩增产物利用3500xL基因分析仪电泳检测，使用ID-X 1.4软件（美国AB公司）进行基因型分析。

2 结 果

2.1 样本结果

15份骨骼样本中有14份获得全部16个STR基因座分型（图1），仅1例结果为阴性，检出率为93.33%。

2.2 案例应用

使用本研究方法对本实验室保存约150年的骨骼进行检验，取骨粉样本150mg按本方法获得12个STR基因座分型，且相对荧光单位（relative fluorescence units，RFU）值低，平均RFU值为600左右。取骨粉样本450mg，20μL洗脱，获得16个STR基因座完整分型（图2）的平均RFU值为1700左右。参照高林林等[2]报道的方法提取该样本，使用AmpFℓSTR®Identifiler®Plus试剂盒扩增检验获得13个基因座的STR分型。

图1 死亡时间30年左右的骨骼DNA分型；图2死亡时间150年左右的骨骼DNA分型

3 讨 论

骨骼外层有致密坚硬的骨密质保护，可较好地抵抗外界环境因素对骨骼样本的侵蚀，使骨DNA得以长期保存，但同时也增加了实验室从骨骼样本中获取模板DNA的难度。虽然随着DNA技术的发展和实验室经验的积累，多数骨骼DNA提取方法成功率超过90%，但一般所需样本量大、检验步骤复杂、耗时长、易污染。高林林等[2]建立的方法有效克服了上述缺点，但其对AutoMate ExpressTM系统的依赖一定程度限制了该方法的推广应用。

本研究建立的骨骼DNA提取方法保留了高林林等[2]建立的方法优势，与传统方法相比，具有：（1）提取时间短，骨粉消化裂解无须EDTA脱钙，仅需消化2h、硅珠纯化约1h，共约3h即可用于扩增；（2）所需检材量少，一般仅需150 mg骨粉；（3）检验步骤简便易于掌握。而以手工硅珠法替代AutoMate ExpressTM自动核酸提取仪对消化后样本进行模板DNA的纯化提取，摆脱了仪器设备对骨骼DNA提取的限制性，具有更强的推广适用性。

本次对保存时间长达150年的骨骼样本分析能够获得成功，主要是因为：（1）增大了骨粉使用量。在本案例应用过程中，当取骨粉样本150mg时，仅获得12个STR基因座分型，且RFU值低；当取骨粉样本450mg以后，成功获得16个STR基因座分型。（2）缩小了洗脱体系。本案例应用的最终洗脱体系为20μL，小体系洗脱，能有效提高模板DNA浓度[3]。（3）手工硅珠法纯化更灵活。使用适当的硅珠量，采用连续振荡的悬浮方式，并适当延长DNA与硅珠的结合时间，可以提高模板DNA的浓度[4]。受AutoMate ExpressTM系统程序设定的限制，高林林等[2]建立的方法因仪器进样吸取消化裂解液体积和最终洗脱体系是固定的，极大地限制了骨粉使用量的增加和模板DNA浓度的提高，针对腐败陈旧骨骼DNA样本缺乏灵活性。而本研究建立的骨骼DNA提取方法可根据骨骼实际情况，通过加大骨粉取样量、缩小洗脱体积等方式，个性化制定提取方案，在陈旧性骨骼DNA检验上更具优势。

综上所述，本研究建立的骨骼DNA提取方法操作简单、便捷、有效，适应性强，值得推广应用。

[1]贾东涛，韩海军，张玉红，等.陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究[J].中国法医学杂志，2007，22（4）：260-261，封3.

[2]高林林，徐念来，谢炜，等.利用AutoMate ExpressTM自动化法医DNA提取系统提取骨骼及牙齿DNA[J].法医学杂志，2013，29（2）：127-129.

[3]董迎春，李诗柳，朱怡，等.改良硅珠法提取DNA的灵敏性及稳定性评价初探[J].中国法医学杂志，2015，30（1）：59-61.

[4]郑小婷，徐念来.硅珠法提取生物检材DNA的影响因素[J].法医学杂志，2016，32（1）：63-64.

2017-07-20）

（本文编辑：张素华）

PrepFiler Express BTATMLysis Buffer Combined with Silicon Microbeads for Rapid DNA Extraction from Bone

DING Shao-cheng,ZHANG Huai-cai,GAO Lin-lin
（Institute of Criminal Science and Technology,Hangzhou Public Security Bureau,Hangzhou 310016,China）

ObjectiveTo establish a convenient and rapid method for extracting DNA from bone.MethodsFifteen long bone samples were washed and sterilized.The skeletal fragments were obtained by electric drill,and lysed by PrepFiler Express BTATMlysis buffer.DNA was then manually extracted by silicon microbeads for further analysis.ResultsSTR genotyping was successfully obtained in 14 out of the 15 samples,and the detection rate was 93.33%.ConclusionThe method for DNA extraction from bone established in present study is convenient,quick,effective,and with a strong applicability,which is worth spreading and applying.

forensic genetics;bone;DNA;PrepFiler Express BTATM;silica-extraction method

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.014

1004-5619（2017）05-0514-02

丁少成（1981—），男，主检法医师，主要从事法医DNA鉴定及法医病理学检验；E-mail：89781168@qq.com