Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性牙龈增生中的表达

崔硕 王鹏 高秀秋

Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性牙龈增生中的表达

崔硕 王鹏 高秀秋

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性增生的牙龈组织中的表达。方法选择正常牙龈对照组、(未服药)高血压牙龈增生组、硝苯地平引起的药物性牙龈增生组各10 例，用Western-Blot和RT-PCR检测牙龈组织中Wnt1、β-catenin的表达。结果药物性牙龈增生组的牙龈组织中Wnt1、β-catenin蛋白及mRNA表达水平显著高于正常牙龈对照组(Plt;0.05)和高血压牙龈增生组(Plt;0.05)。结论硝苯地平引起的药物性牙龈增生的牙龈组织中Wnt1、β-catenin表达水平增高，可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙龈成纤维细胞的增殖导致牙龈纤维化。

药物性牙龈增生(DGO)； Wnt1； β-catenin； Wnt/β-catenin信号通路

药物性牙龈增生(drug-induced gingival overgrowth，DGO)是由于长期服用某些药物引起的牙龈增生性疾病，它的主要特征是牙龈的纤维性增生和体积增大。引起牙龈增生的药物主要包括钙离子拮抗剂、抗癫痫药以及免疫抑制剂[1]。有文献认为牙龈增生与肺纤维化有着相似之处[2]。Wnt/β-catenin信号通路参与了肺纤维化的发生、发展，它的激活能诱导成纤维细胞增殖,并活化转变为肌成纤维细胞,促进细胞外基质大量沉积。Wnt1、β-catenin蛋白作为Wnt/β-catenin信号通路的主要蛋白，在肺纤维化的发生发展中发挥了重要作用[3]。因此我们推测Wnt/β-catenin信号通路对药物性牙龈增生的发生也有一定的调控作用。硝苯地平引起的牙龈增生是目前临床上较为常见的药物性牙龈增生，因此本实验以硝苯地平引起的药物性牙龈增生为研究对象，研究其与Wnt信号通路的关系。本研究通过检测药物性牙龈增生患者牙龈组织中Wnt1、β-catenin的表达，初步探讨Wnt/β-catenin信号通路对药物性牙龈增生的调控作用。

1 资料与方法

1.1 试剂与设备

1.1.1 主要试剂 Trizol(TaKaRa)；逆转录试剂盒(TaKaRa RNA PCRTM Kit Ver 3.0)；Wnt1、β-catenin、β-actin引物合成(大连宝生物工程有限公司)；β-catenin抗体(proteintech)；Wnt1抗体(Elabscience)；β-actin抗体(Elabscience)；超敏ECL 化学发光试剂盒(Beyotime)等。

1.1.2 主要设备 超净工作台( YJ-875，苏州星湖恒晟洁净设备有限公司)；PCR仪( TC-412，TECHNE，英国)；低温超速离心机( Z323K，HERMLE，德国)；转膜仪(Trans-Blot SD)，凝胶成像分析系统[(Gel Doc XR+)BIO-RAD，美国]等。

1.2 病例的选择

选择2013-08～2014-05在锦州医科大学附属第二医院牙周病就诊的因硝苯地平引起的牙龈增生患者10 例(药物性牙龈增生组)；未服药的高血压牙龈增生患者10 例(高血压牙龈增生)以及正常牙龈对照者10 例(正常牙龈对照组)。入选者已知研究目的，参加本研究的潜在危险和利益，并签署知情同意书。

服用硝苯地平的牙龈增生组纳入标准[4]：①有高血压病史，服用硝苯地平时间大于半年；②伴有牙龈增生且上下颌前牙区严重；③排除糖尿病等其他全身性疾病；④未同时服用苯妥英钠、环孢菌素A等其他引起牙龈增生的药物；⑤近半年内未接受过牙周基础治疗；⑥入选前3个月及观察期内无抗生素服用史；⑦知情同意并能够按时复诊。

排除标准：①行动不便不能接受复诊者；②治疗和观察期间换用非钙拮抗剂类降压药物者；③口服避孕药者；由非钙拮抗类药物(如苯妥英钠、环胞菌素-A)引起的牙龈增生者。

分组：正常牙龈对照组(A)：选10名于我院因美观或修复原因，行冠延长术的患者。高血压牙龈增生组(B)： 10例牙龈增生患者有高血压，但是未服用任何降压药，病情稳定。药物性牙龈增生组(C)：10例因服用硝苯地平而引起的牙龈增生患者。

1.3 实验方法

1.3.1 样本的获取和保存 局麻下在牙齿唇颊侧牙龈近、远中垂直切至牙周袋底或龈沟底，另在袋底或沟底行水平切口。获得的牙龈标本在-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3.2 Western-Blot检测牙龈组织中Wnt1、β-catenin在蛋白水平的表达 ①制备蛋白样品放于-80 ℃保存；②利用Bradford试剂盒测定总蛋白含量；③将样品调成相同浓度，加入buffer，沸水煮5 min；④聚丙烯酰胺凝胶电泳：每例标本20 μl上样，电泳(电压80 V、电流40 mA)；⑤转膜：半干式电转印，聚丙烯酰胺凝胶浸入Transfer buffer 30 min，PVDF膜于甲醇中浸透后浸入Transfer buffer 10 min，恒电压21 V转移23 min，TBS洗5 min；⑥封闭：用封闭液室温振摇封闭1 h；⑦一抗孵育4 ℃摇床过夜，TBST洗膜3 次/5 min；⑧二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3 次/5 min；⑨化学发光，显影，定影，利用Gel-Pro Ananlyzer软件进行图像分析。

1.3.3 RT-PCR检测牙龈组织中Wnt1、β-catenin在核酸水平的表达 ①用TRIzol提取牙龈样本总RNA;②逆转录合成cDNA：反应条件42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min， 5 ℃ 5 min,1 个循环，-80 ℃保存；③引物设计合成(由大连宝生物公司设计合成)，β-actin为内参对照(表 1);④PCR扩增：PCR反应体系：(β-actin)10×Taq Buffer 5 μl，MgCl24 μl,dNTP 1 μl,引物 3 μl，cDNA模版 1 μl，Taq DNA 0.5 μl，超纯水35.5 μl，总体系50 μl；(Wnt1、β-catenin)10×Taq Buffer 2 μl，dNTP 1 μl,引物 2 μl，cDNA模版 1 μl，Taq DNA 0.2 μl，超纯水13.8 μl，总体系20 μl。PCR反应条件：(β-actin)95 ℃预变性5 min，95 ℃变形45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,35 个循环；(Wnt1)95 ℃预变性5 min，95 ℃变形45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,30 个循环；(β-catenin) 95 ℃预变性5 min，95 ℃变形45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,30 个循环;⑤琼脂糖凝胶电泳分析：取PCR产物10 μl，经1.5%(β-actin)、2%(Wnt1、β-catenin)琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统仪内扫描，使用Quantity One 软件分析结果，以β-actin RNA的吸光度值进行标准校正。

表 1 PCR引物序列及反应条件

1.4 数据处理

2 结 果

2.1 3 组牙龈组织中Wnt1、β-catenin蛋白的表达

药物性牙龈增生组C(0.322±0.067)与正常牙龈组A(0.014±0.008)相比，Wnt1蛋白的表达显著上升(Plt;0.05)；与高血压牙龈增生组B(0.082±0.031)相比，Wnt1蛋白的表达显著上升(Plt;0.05)；B组与A组相比，Wnt1蛋白的表达差异无统计学意义(Pgt;0.05)(图 1)。

C组(0.209±0.099)与A组(0.063±0.014)相比，β-catenin蛋白的表达显著上升(Plt;0.05)；C组与B组相比，β-catenin蛋白的表达显著上升(Plt;0.05)；B组(0.098±0.022)与A组(0.063±0.014)相比，β-catenin蛋白的表达差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

图 1 牙龈组织中Wnt1、β-catenin蛋白的表达

2.2 3 组牙龈组织中Wnt1、β-catenin mRNA的表达

药物性牙龈增生组C(1.254±0.042)与正常牙龈组A(0.088±0.002)相比，Wnt1 mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)；与高血压牙龈增生组B(0.757±0.029)相比，Wnt1 mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)；B组与A组相比，Wnt1 mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)(图 2)。

图 2 牙龈组织中Wnt1、β-catenin mRNA的表达

C组(1.545±0.087)与A组(0.386±0.027)相比，β-catenin mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)；与高血压牙龈增生组B(0.547±0.028)相比，β-catenin mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)；B组与A组相比，β-catenin mRNA的表达显著上升(Plt;0.05)。

3 讨 论

药物性牙龈增生是指服用某种药物所引起的牙龈组织过度生长和牙龈体积的增大。牙龈增生常首先发生于前牙而后向其他牙位扩展[5]，并表现为纤维性增生。各类药物引起的牙龈增生的发生率不同，根据不同文献报道,硝苯地平引起牙龈增生的发生率为0.5%～83%[2.6-7]。牙龈增生会带来不同程度的危害，过度增生的牙龈组织可干扰正常的口腔功能，如咀嚼、吞咽、发音等，增生的牙龈可以挤压牙齿使其移位，损害发音并影响外形美观[8]。硝苯地平是钙通道阻滞药，是治疗心血管系统疾病的常用药，其通过与Ca2+通道特异性受体结合，阻滞Ca2+内流，在细胞因子如IL-2、整合素等的共同作用下，引起牙龈成纤维细胞增殖和胶原代谢失衡[7]。硝苯地平引起的牙龈增生主要表现为上下颌前牙区较重，并仅发生于有牙区，病理变化主要表现为上皮棘层显著增厚，钉突伸长达到结缔组织深部，结缔组织有致密的胶原纤维束、大量成纤维细胞和新生血管，间有多量无定形基质，炎症细胞较少。

Wnt1基因由370 个氨基酸组成，相对分子质量介于42 000～48 000之间，信号肽为一条含27 个氨基酸的短肽。包括4 个潜在的N连糖基化位点，外加23 个半胱氨酸。23 个半胱氨酸中有12 个位于该分子最后70 个氨基酸之中，其中2 个对于潜在的N连糖基化位点有重要作用[9]。β-catenin是Wnt信号通路中有调控转录活性的关键成员，能在细胞核内与TCF结合从而激活靶基因的转录，β-catenin 基因定位于3p21，由16 个外显子组成，其中外显子3的第37、33、41、45位密码子编码区域构成β-catenin 蛋白的NH2末端[10]。Wnt/β-catenin信号通路作为Wnt经典通路与各类肿瘤性疾病的发生发展密切相关[11]。Wnt1、β-catenin被证实参与多种癌症的发生发展，如宫颈癌[8]、前列腺癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]等。有研究表明Wnt信号通路对骨髓基质干细胞向成牙本质细胞样分化的过程中起到了一定的调控作用[15]。近年来发现Wnt/β-catenin信号通路在纤维化疾病中异常活跃，提示该通路可能参与纤维化形成过程。Konigshoff等[16]把肺纤维化患者与移植供体肺比较发现Wnt1、β-catenin、Wnt7b、Wnt10b在肺纤维化患者中均显著增加。宋萍[3]实验报道肺纤维化模型鼠肺组织β-catenin蛋白及mRNA表达升高，Wnt1干预人胚成纤维细胞，细胞增殖呈剂量依赖方式。表明Wnt/β-catenin信号通路能促进成纤维细胞的增殖及分化，在形成纤维化疾病中起着重要作用。但是关于Wnt信号通路与药物性牙龈增生的相关性研究却鲜有报道。

Wnt/β-catenin信号通路调控干细胞的增殖分化，正常成熟细胞中无Wnt信号，细胞质内游离的β-catenin水平很低，当Wnt信号通路被激活时，β-catenin在细胞质内大量聚集，并转位进入细胞核，启动靶基因转录，最终导致细胞的增殖和转移[17-18]。药物性牙龈增生中成纤维细胞增殖、迁移、黏附，进而造成组织纤维化。多项研究表明在纤维化器官中Wnt/β-catenin通路蛋白表达增强，信号通路异常活跃，阻断该信号通路后，纤维化标志因子表达减少，胶原纤维沉积减少，抑制了纤维化进程[19-20]。有研究表明DKK1通过与LRP5/6结合,抑制Wnt诱导的β-catenin/TCF依赖性基因转录来阻断Wnt/β-catenin信号通路的活化[21]。He等[19]在阻塞性肾损伤模型中发现肾小管上皮细胞中β-catenin表达显著增多,经典wnt通路活化,LEF1和纤维连接蛋白表达增强,而运用DKK1后,β-catenin显著减少且Wnt/β-catenin靶基因被抑制,同时,DKK1抑制了肌成纤维细胞的活化,纤维细胞特异蛋白-1(FSP-1)、胶原蛋白I及纤连蛋白表达下调,导致阻塞肾模型中胶原纤维总量下降。以上研究表明Wnt/β-catenin活化导致肌成纤维细胞活化，进一步导致组织纤维化，这与本研究中药物性牙龈增生患者牙龈组织中Wnt1、β-catenin蛋白的高表达呈现一致性。

本研究用Western-Blot、RT-PCR分别检测正常牙龈、未服药高血压牙龈增生患者牙龈、硝苯地平引起的药物性牙龈增生患者牙龈中Wnt1、β-catenin蛋白及mRNA的表达，结果显示药物性牙龈增生组Wnt1、β-catenin明显高于另外2 组，表明Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的药物性牙龈增生的发生中起到一定的调控作用。但是高血压牙龈增生组与正常对照组相比Wnt1、β-catenin的蛋白及mRNA表达结果不一致，两者之间蛋白表达是否有差异还需要进一步验证，另外Wnt1、β-catenin调控药物性牙龈增生的具体作用机制还有待进一步探讨。硝苯地平引起的药物性牙龈增生与Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达有一定相关性，通过Wnt/β-catenin信号通路抑制剂来干扰信号通路活化从而阻止纤维化进程可能为今后治疗药物性牙龈增生提供新的方向。

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(收稿： 2016-10-16)

ExpressionofWnt1andβ-catenininthegingivaltissurewithgingivalovergrowthinducedbynifedipine

CUIShuo,WANGPeng,GAOXiuqiu.

121000,TheSecondAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity，China

Objective： To study the expression of Wnt/β- catenin signaling pathway related proteins Wnt1 and β- catenin protein in gingival tissues of the patients with drug-induced gingival overgrowth(DGO) caused by nifedipine.MethodsWnt1 and β- catenin expression were tested with Western Blot and RT-PCR in gingival tissues of 10 cases of DGO induced by nifedipine, 10 cases of high blood pressure with gingival hyperplasia(without use of any medicine) and 10 cases of healthy control.ResultsIn the gingival tissues of DGO group the levels of Wnt1 and β- catenin protein and mRNA were significantly higher than those of the healthy control group(Plt;0.05) and the high blood pressure group(Plt;0.05).ConclusionThe levels of Wnt1 and β-catenin are increased in nifedipine induced gingival hyperplasia. The gingival hyperplasia may be caused by the promotion of gingival fibroblast proliferation through Wnt/β- catenin signaling pathway.

Drug-inducedgingivalhyperplasia(DGO);Wnt1;β-catenin;Wnt/β-cateninsignalingpathway

全民口腔研究生科研创新基金(编号： QM2014014)

121000， 锦州医科大学附属第二医院

高秀秋 E-mail: jzgaoxiuqiu1988@163.com

R781.4+1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.017