uc.189 在宫颈癌组织中的表达及意义

李 芹 沈飞扬 贾筱琴 王成海

(扬州市职业大学医学院，江苏 扬州 225009)

uc.189 在宫颈癌组织中的表达及意义

李 芹 沈飞扬1贾筱琴1王成海1

(扬州市职业大学医学院，江苏 扬州 225009)

目的研究超保守序列uc.189 在宫颈癌组织中的表达及其与病理分级及临床分期的关系。方法从40例宫颈癌及40例宫颈正常组织中提取总RNA，运用实时荧光定量PCR技术检测uc.189 mRNA水平表达变化，分析其与宫颈癌临床病理特征的关系。结果与癌旁正常组织相比，uc.189 mRNA在宫颈癌组织中的表达明显增高(Plt;0.05)，其高表达与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移密切相关。结论宫颈癌的发生发展与uc.189的高表达密切相关。

uc.189；超保守RNA；宫颈癌；病理分级；淋巴结转移

近年研究表明宫颈癌的发病年龄呈现年轻化趋势，且腺癌比例也逐渐增加〔1〕。超保守RNA(UCR)是一类生物进化中绝对高度保守的非编码DNA分子，由超过200个核苷酸的基因序列组成。目前研究发现481种UCR的基因序列，它们广泛存在于人、小鼠和大鼠等生物中〔2,3〕，在不同的动物物种中UCR基因序列一模一样。这些UCR中许多都能转录成RNA，其功能主要是通过调节细胞内RNA分子来调控编码和其他非编码基因的表达，进一步影响细胞的生长、分化、侵袭转移及细胞凋亡，参与肿瘤的发生发展等生物学过程，其与癌症发生发展的关系更是当前肿瘤研究新热点之一〔4～6〕。本研究检测uc.189的表达与宫颈癌病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取扬州大学临床医学院妇产科2014年6月至2015年5月手术患者40例，经术后病理证实宫颈癌，年龄33～76(平均58.6)岁，所有患者术前未经过放疗、化疗处理，并签署知情同意书。新鲜组织标本采集后立即放入液氮罐里，-80℃冰箱长期保存。

1.2引物设计与合成 uc.189与内参U6的qRT-PCR 引物序列由本实验组设计提供，合成的引物购买于上海生工生物工程公司。uc.189上游引物5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′，下游引物5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′；U6-上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U6-下游引物5′- CGCTTCAC GAATTTGCGTGT-3′。

1.3提取总RNA 实验步骤如下：称取0.1 g新鲜标本放入研钵(经液氮预冷)中研磨成细粉状；迅速用药匙取细粉加入含1 ml TRizol离心管中；室温下10 min剧烈振荡，让细粉充分裂解，静止数秒；4℃ 12 000 r/min，离心10 min；将上清液取入新离心管，加入200 μl 氯仿；室温下振荡5 min 期间不断振荡，静置2 min；4℃ 12 000 r/min，离心10 min；将上清液迅速加入新离心管，取500 μl 异丙醇缓慢颠倒入离心管。室温沉淀20 min，然后4℃ 12 000 r/min，离心10 min，弃上清；离心管加入1 ml 75%乙醇，小心弃上清，再加入1 ml 75%乙醇振荡器振荡使沉淀悬浮，4℃ 10 000 r/min，离心5 min，弃上清。超净台中自然干燥2 min，加入16 μl DEPC 处理的双蒸水溶解。提取总RNA 1 μl后检测 OD 值，A260/280比值在1.8～2.2之间，为高纯度RNA，并调整RNA浓度，或进行下一步实验或保存于-80℃。

1.4合成cDNA 使用Takara生物公司PrimeScript RT试剂盒Perfect Real Time试剂盒逆转录获取cDNA。反应体系共10 μl，RNA约40 ng，5倍上样缓冲液2μl，PrimeScript RT酶混合物Ⅰ0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，添加DEPC水调整体系至10 μl。反应条件37℃ 15 min，85℃ 5 s，反应产物保存于4℃。

1.5qRT-PCR 使用Takara生物公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Perfect Real Time 试剂盒，反应体系为20 μl，具体包括 1 μl cDNA，10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，上下游引物各0.5 μl，加DEPC水调整反应体系至20 μl，每组样本有3个复孔，小分子RNA-U6被设置为内参；实验在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR仪器上进行。最后读取定量PCR反应 Ct 值，计算2-ΔΔCt。

1.6统计学方法 采用 SPSS16.0统计软件和GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1qRT-PCR 结果分析 宫颈癌组与癌旁正常组uc.189 mRNA表达差异显著〔(9.76±4.112)vs (4.76±1.426),Plt;0.05〕。

2.2宫颈癌组织中uc.189 mRNA的表达水平与临床病理特征之间的关系 宫颈癌组织uc.189 mRNA的表达量与淋巴结转移及分化程度有关(Plt;0.05)，与年龄、肿瘤分型、肿瘤大小、浸润深度、远端转移和病理分期均无相关性(Pgt;0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织中uc.189 mRNA表达与临床病理特征的关系

3 讨 论

女性第一位最常见的恶性肿瘤是乳腺癌，第二位常见的恶性肿瘤是宫颈癌，而且宫颈癌是女性第四位病死的原因〔7〕。目前在全球范围宫颈癌的发病率有所下降，但在发展中国家仍呈上升的趋势〔8〕。研究表明我国每年新增宫颈癌的病例约10万例，局部地区的发病率和死亡率都有增长趋势，而且还呈现年轻化的趋势〔9〕。

目前与宫颈癌发生发展有密切关联的因素包括细菌和病毒等微生物的感染、宫颈的损伤及早婚早育早产。已有研究证实，p53和k-ras基因的突变〔10,11〕，c-myc、HER-2 和EGFR基因的过表达以及PTEN基因低表达均与宫颈癌发生发展有关〔12～14〕。总之，多种致病因素相互叠加综合作用与正常的宫颈细胞，最终导致宫颈癌的发生发展。

目前认为非编码蛋白的RNA分子包括微小RNA、长链非编码RNA和超保守RNA等，它们可以转录成RNA，但不能翻译成蛋白质；主要功能是调控相关的RNA分子从而进一步调节编码基因或非编码基因的表达。当前的研究热点集中于微小RNA和长链非编码RNA。比如在microRNA与宫颈癌的关系中，microRNA124、microRNA218和microRNA101在宫颈癌组织和细胞中低表达，其调控的信号通路抑制了肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭转移和增强对化疗的敏感性等过程中发挥重要作用〔15～17〕，而microRNA155和microRNA10a却在宫颈癌组织中高表达进而促进了肿瘤细胞的增殖、分化和浸润转移〔18,19〕；另外在长链非编码RNA与宫颈癌的关系研究中，长链非编码RNA-HOTAIR在宫颈癌组织中显著高表达，因此HOTAIR被认为是一种癌基因，其与宫颈癌的恶性进展与预后不佳密切相关〔20,21〕；而作为抑癌基因的长链非编码RNA：GAS5和LET则在宫颈癌中低表达，它们的作用是抑制宫颈癌的发生发展〔22,23〕。

UCR是第3类非编码RNA分子，是由超过200个的碱基序列组成，目前发现了481种UCR的正链DNA及同样数量的反链DNA的UCR，它们存在于小鼠、大鼠和人等生物中〔2,3〕，其基因序列绝对保守而一模一样。他们可以转录成RNA分子，调控其他的RNA分子影响DNA的转录与翻译等，从而进一步影响肿瘤细胞的分化发育、侵袭转移及预后，并且参与肿瘤的发生发展过程，因此UCR与癌症发生发展及预后的关系越来越成为肿瘤研究新的热点。目前UCR科学家们已经在肝癌，大肠癌 白血病和胶质瘤进行了大量的科学研究〔4～6〕。

本研究提示uc.189可能作为一个促癌基因，参与了宫颈癌的发生和发展过程，为宫颈癌的临床诊断治疗提供了一个潜在的生物学靶点。

1Holtz DO,Dunton C.Traditional management of invasive cervical cancer〔J〕.Obstet Gynecol Clin North Am,2002;29(4):645-57.

2Bejerano G,Lowe CB,Ahituv N,etal.A distal enhancer and an ultraconserved exon are derived from a novel retroposon〔J〕.Nature,2006;441(7089):87-90.

3Katzman S,Kern AD,Bejerano G,etal.Human genome ultraconserved elements are ultraselected〔J〕.Science,2007;317(5840):915.

4Calin GA,Liu CG,Ferracin M,etal.Ultraconserved regions encoding ncRNAs are altered in human leukemias and carcinomas〔J〕.Cancer Cell,2007;12(3):215-29.

5Mestdagh P,Fredlund E,Pattyn F,etal.An integrative genomics screen uncovers ncRNA T-UCR functions in neuroblastoma tumours〔J〕.Oncogene,2010;29(24):3583-92.

6Braconi C,Valeri N,Kogure T,etal.Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2011;108(2):786-91.

7Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011;61:69-90.

8Kent A.HPV vaccination and testing〔J〕.Rev Obstet Gynecol,2010;3(1):33-4.

9张一娇，丁晓萍.宫颈癌组织中Has-miRNA-199a-5p 的表达变化〔J〕.山东医药，2012;52(6):40-2.

10Ito S,Tase T,Satoh K,etal.Gastric-type endocervical glandular neoplasms associated with aberrant p16 expression and K-RAS gene mutation in Peutz-Jeghers syndrome〔J〕.Pathol Int,2014;64(6):283-8.

11Myllynen L,Rieckmann T,Dahm-Daphi J,etal.In tumor cells regulation of DNA double strand break repair through EGF receptor involves both NHEJ and HR and is independent of p53 and K-Ras status〔J〕.Radiother Oncol,2011;101(1):147-51.

12Gasparian NA,Pozharisskii KM,Zharinov GM,etal.Immunohistochemical study of the predictive value of oncoproteins p53,HER-2 and c-myc during radiotherapy for squamous cell carcinoma of the cervix〔J〕.Vopr Onkol,2007;53(4):439-44.

13Bumrungthai S,Munjal K,Nandekar S,etal.Epidermal growth factor receptor pathway mutation and expression profiles in cervical squamous cell carcinoma:therapeutic implications〔J〕.J Transl Med,2015;25(13):244.

14Lee PMS,Jeong MH,Lee HW,etal.I3K/AKT activation induces PTEN ubiquitination and destabilization accelerating tumourigenesis〔J〕.Nat Commun,2015;17(6):7769.

15Wan HY,Li QQ,Zhang Y,etal.MiR-124 represses vasculogenic mimicry and cell motility by targeting amotL1 in cervical cancer cells〔J〕.Cancer Lett,2014;355(1):148-58.

16Dong R,Qiu H,Du G,etal.Restoration of microRNA 218 increases cellular chemosensitivity to cervical cancer by inhibiting cell cycle progression〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(6):3289-95.

17Liang X,Liu Y,Zeng L,etal.miR-101 inhibits the G1-to-S phase transition of cervical cancer cells by targeting Fos〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2014;24(7):1165-72.

18Liu P,Wu Q,Zhang W,etal.Mir-155 promotes cervical cancer cell proliferation through suppression of its target gene LKB1〔J〕.Tumour Biol,2014;35(12):11933-8.

19Zeng T,Li G.MicroRNA 10a enhances the metastatic potential of cervical cancer cells by targeting phosphatase and tensin homologue〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(3):1377-82.

20Li J,Wang Y,Yu J,etal.A high level of circulating HOTAIR is associated with progression and poor prognosis of cervical cancer〔J〕.Tumour Biol,2015;36(3):1661-5.

21Kim HJ,Lee DW,Yim GW,etal.Long non-coding RNA HOTAIR is associated with human cervical cancer progression〔J〕.Int J Oncol,2015;46(2):521-30.

22Cao S,Liu W,Li F,etal.Decreased expression of lncRNA GAS5 predicts a poor prognosis in cervical cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(10):6776-83.

23Jiang S,Wang HL,Yang J.Expression of long non-coding RNA LET inhibits carcinogenesis of cervical cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(1):806-11.

〔2016-08-26修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R737.33

A

1005-9202(2017)21-5342-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.056

江苏省高校“青蓝工程”资助项目(2012～2015)；扬州市重点研发计划-社会发展(YZ2016065)

1 扬州大学附属医院

王成海(1967-)，男，博士，副教授，主要从事肿瘤与中药干预治疗研究。

李 芹(1973-)，女，硕士，副教授，主要从事妇产科基础研究。