可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对原位肝癌小鼠的治疗效果

侯 杰 焦成斌 尚进才 张晓丽 罗 兰

(佳木斯大学附属第一医院普外二科，黑龙江 佳木斯 154002)

可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对原位肝癌小鼠的治疗效果

侯 杰 焦成斌 尚进才 张晓丽 罗 兰1

(佳木斯大学附属第一医院普外二科，黑龙江 佳木斯 154002)

目的评价可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对原位肝癌小鼠的抗肿瘤效果。方法通过外科手术将肝癌H22细胞种植于昆明鼠的左肝内，构建原位肝癌小鼠肿瘤模型。将4价奥沙利铂(Ⅳ)药物连接到高分子载体上，组装成纳米药物，将该纳米药物同小分子奥沙利铂(Ⅱ)对肝癌的治疗效果进行比较。结果成功构建了小鼠肝癌原位模型，并通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)实验及肿瘤机制实验证实可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物更有效，生物毒性更低。结论可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对原位肝癌小鼠有较好的治疗效果，并明显降低了铂药的毒副作用。

原位肝癌模型；高分子键合药；纳米胶束；靶向治疗

世界卫生组织统计，每年(45～55)万人死于肝癌〔1～3〕，Jemal等〔4〕报道，全球每年肝癌新发病例超过70万，我国每年肝癌新发病例约占全球一半以上〔5〕。据世界卫生部门统计〔6〕，肝癌的死亡率在消化系统各类恶性肿瘤中高居第2位，仅次于胃癌，我国肝癌患者平均发病年龄较轻〔7〕。肝癌的治疗手段有手术、化疗、放疗、介入治疗、中医、中药治疗〔8〕等，目前主要是手术切除肿瘤组织〔9〕，临床上肝癌发现多数是疾病晚期，丧失手术机会且预后较差〔10〕。为了保证治疗效果，在肝癌化疗方案中选用的多种化疗药物往往剂量很大，并且靶向性不强，对机体产生较明显的毒副作用，出现高效高毒现象，化疗引起的恶心、呕吐是最常见的不良反应〔11，12〕，病人的生存质量差，生存期延长有限。提高临床化疗效果有两点关键因素，①药物对肿瘤的靶向性治疗，有效提高化疗药物靶向性；②如何有效降低药物本身对机体产生的毒副作用。临床上肝癌患者化疗时，多采用的是小分子2价的奥沙利铂(Ⅱ)药物，但奥沙利铂(Ⅱ)药物同其他铂药一样，本身具有毒副作用大、靶向性差、在循环中有效血药浓度时间短等问题。本实验构建了昆明鼠的原位肝癌动物模型，试图通过动物和细胞实验证实可生物降解4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米胶束M(Pt)药物较2价奥沙利铂(Ⅱ)更有效，生物毒性更低，具有更高效的抗肿瘤效果。

1 材料与方法

1.1动物、细胞、主要试剂 雄性昆明小鼠，体重为18～22 g，采购自北京协和实验动物中心；造模应用的腹水型H22肝癌细胞、RPMI1640培养基及磷酸盐缓冲液(PBS)均为中科院长春应用化学研究所提供；实验应用的两亲性嵌段共聚物——聚乙二醇-聚己内酯-聚赖氨酸(mPEG-b-PCL-b-PLL)与铂(Ⅳ)的键合物在中科院长春应用化学研究所实验室内合成。

1.2昆明鼠原位肝癌模型的制备 消毒条件下，注射器抽取实验室动物房内昆明鼠腹腔内传代保存的腹水型肝癌H22细胞株，在腹腔液中缓慢加入PBS，低速离心，弃去上清液，电子显微镜下精确计数肝癌H22细胞数，准确调整H22单细胞液浓度为2×107/ml备用，单只实验昆明鼠左叶肝脏接种H22细胞数量为单细胞悬液0.05 ml(1×106个细胞)，用胰岛素针注射于实验小鼠肝左叶膈面，严格注意进行无菌、无瘤操作原则。造模1 w后，在实验室严格消毒条件下将100只实验小鼠实施麻醉后进行剖腹检查，95只左肝叶可见癌肿生成，肿物表面凹凸不平，呈现灰白颜色，浸润性生长，突出肝脏表面，质地硬，说明原位肝癌模型造模成功，其中有5只肿瘤逃逸，出现癌性腹水，远处转移，并有腹腔内种植转移，原位肝癌模型实验成瘤率为95%。

1.3细胞毒性试验 应用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的方法对比奥沙利铂(Ⅱ)、M(Pt)的体外抗癌活性。

1.4组织分布 通过断髓法分批处死实验小鼠，分别于1、3、6、9、12、24 h摘取原位肝癌实验小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官，并分离出健康肝组织及肿瘤组织，应用电感耦合等离子体发射光谱(ICP)方法提取出两种铂药的金属铂，测定各个器官内两种实验药物的铂药含量。

1.5肿瘤抑制实验 原位肝癌实验小鼠，分别随机抓取18只作为对照组(注射生理盐水)、奥沙利铂(Ⅱ)组及M(Pt)组，分别于1、3、5、7、9、11 d处死每组各3只，将原位肝癌肿瘤组织完整剥除，采用肿瘤的体积测量公式：长×宽2×0.5〔13〕，电脑测算出每组肝脏肿瘤的体积，取平均值。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1两种药物对人肝肿瘤细胞株(HepG-2)48、72 h的细胞毒性 48 h内，奥沙利铂(Ⅱ)对HepG-2细胞的毒性较M(Pt)大，HepG-2细胞的杀灭效果较M(Pt)好；随时间延长，72 h M(Pt)对HepG-2细胞的毒性较奥沙利铂(Ⅱ)大，对HepG-2细胞的杀灭效果较奥沙利铂(Ⅱ)好，差异均显著(均Plt;0.05)。见图1。

图1 奥沙利铂(Ⅱ)、M(Pt)对HepG-2细胞48、72 h的细胞毒性

2.2两种药物在不同器官的含量 M(Pt)在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织中含量均显著高于奥沙利铂(Ⅱ)(Plt;0.05)，见图2。

2.3两种药物对肿瘤体积的抑制效果 M(Pt)组对肿瘤体积的抑制效果显著好于奥沙利铂(Ⅱ)组(Plt;0.05)。见图3。

图2 奥沙利铂(Ⅱ)、M(Pt)在不同器官含量的测定

图3 奥沙利铂(Ⅱ)、M(Pt)对肿瘤体积的抑制效果

3 讨 论

在化疗药物中，铂配合物抗癌药物在临床上占有重要的地位，应用量大，约占全部抗癌药物的一半以上〔14～16〕，在原有“高分子键合药”前期工作的基础上，研制双亲性嵌段共聚物与铂(Ⅳ)的键合物，药物含量达到临床治疗上的足够高的铂药剂量，并有效降低了金属铂药的毒性，在真正意义上实现对金属奥沙利铂(Ⅱ)药物的有效保护和靶向输送，为癌症的检测和治疗开辟了新途径〔17〕，铂(Ⅳ)从高分子键合物上释放和还原成奥沙利铂(Ⅳ)的过程通过细胞和动物实验证明纳米铂药抗肿瘤效果优于奥沙利铂(Ⅱ)，真正意义上为高分子-铂(Ⅳ)键合药的研究提供了理论基础，为纳米药物的临床应用提供可供参考的实验依据，开创性地创造出了低毒高效铂类抗癌药物的新品种〔18～20〕。构建肝癌的动物模型的方法主要包括自发性、诱发性、移植性、人类肝癌的异种移植模型及转基因动物肝癌模型，既往实验采用的动物模型绝大多数为移植性模型，且多为异位的动物模型，原位模型极少，这与原位动物模型的构建困难有关，但异位动物模型实验结果不完全可靠，并不能完全真实地反映疾病的病理改变及治疗效果。本文构建的昆明鼠原位肝癌种植模型，在实践上具有高度的临床实用性和相关性，易于开展和普及，实验周期短，造模成功率高，在进行抗肿瘤药物治疗过程中能更好地真实模拟肝癌在人体内的生物学特性及破坏行为，在临床试验研究中具有极大的应用价值。从仿生学的角度设计和制备可控的铂类高分子纳米药物，该药物具有和生物体内环境相应的大小、形态、表面性能的特点。M(Pt)药物在肝脏组织中具有截留效应，在肿瘤组织中具有高通透性和滞留效应(EPR)〔21〕，确实提高了药物在肿瘤部位的蓄积，胶束药物可以有效发挥抗肿瘤作用及达到缓释的效果，更长久地发挥抗肿瘤效果。

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〔2016-10-22修回〕

(编辑 王一涵)

R735.7

A

1005-9202(2017)21-5241-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.010

黑龙江省青年基金(No.QC2013C101)；佳木斯大学青年基金(No.Sq2013-023)

1 佳木斯大学附属第一医院消化一科

罗 兰(1978-)，女，硕士，副主任医师，主要从事消化系统疾病研究。

侯 杰(1978-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事肝胆外科研究。