Six1对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响

罗 方 许玲玉 李清楚 康志强

(郑州大学附属郑州中心医院内分泌科，河南 郑州 450000)

Six1对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响

罗 方 许玲玉 李清楚 康志强

(郑州大学附属郑州中心医院内分泌科，河南 郑州 450000)

目的探讨Six1对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响。方法甲状腺癌BCPAP细胞转染Six1小干扰RNA(Six1 siRNA)和小干扰RNA阴性对照(siRNA control)，采用细胞划痕实验检测细胞迁移，Transwell小室检测细胞侵袭，Western印迹检测Six1、神经钙黏素(N-cadherin)、上皮钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达。结果转染siRNA control后的BCPAP细胞迁移率、侵袭细胞数目及细胞中Six1、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平与没有转染的BCPAP细胞相比无变化。转染Six1 siRNA后的BCPAP细胞迁移率、侵袭细胞数目及细胞中Six1、N-cadherin蛋白表达水平与没有转染的BCPAP细胞相比明显降低，而E-cadherin蛋白水平明显升高。结论敲低Six1可能通过影响E-cadherin、N-cadherin表达抑制甲状腺癌细胞侵袭迁移。

甲状腺癌；Six1；侵袭；迁移

甲状腺癌属于内分泌系统肿瘤，其发病率在全部恶性肿瘤中占1%，碘元素缺乏、放射线、甲状腺功能异常及遗传等均能够引起甲状腺癌的发生〔1〕。手术治疗、内分泌治疗、放射性核素治疗是目前常用的治疗方法。Six1是一种与胚胎发育有关的转录因子，在正常的发育成熟组织中极少表达，而在多种肿瘤组织中表达上调〔2〕。Six1表达上调常与乳腺癌等肿瘤的预后有关〔3〕，有研究表明Six1影响宫颈癌等肿瘤细胞转移和增殖能力〔4〕。本研究通过细胞转染的方法下调甲状腺癌细胞中Six1的表达，初步探讨Six1敲低对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 甲状腺癌BCPAP细胞购自中科院细胞库；Six1抗体购自美国Santa Cruz ；Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂购自美国Thermo；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自北京TIANGEN ；神经钙黏素(N-cadherin)抗体、上皮钙黏附素(E-cadherin)抗体、β肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Sigma；胎牛血清购自美国Gibco；倒置显微镜购自日本Olympus Corporation。

1.2细胞分组及转染 甲状腺癌BCPAP细胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和链霉素的RPMI1640细胞培养液中培养。在相对湿度95%，5%CO2，37℃的培养箱中培养。期间每隔3 d进行一次传代，0.25%的胰蛋白酶消化传代。观察细胞饱和度约为70%时进行细胞转染，转染步骤参照Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂说明书。将转染siRNA-Six1和siRNA control的细胞分别记为siRNA-Six1组、阴性对照组，同时以没有转染的细胞为未转染组。

1.3细胞划痕检测细胞迁移 在6孔细胞培养板的背面用记号笔均匀的划线。取未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞，按照每孔中加入5×105个细胞接种到划线后的细胞培养板中，培养1 d待细胞长满后用移液枪枪头垂直的在培养板上划出细痕，使细痕与培养板背面的划线重合。用磷酸盐缓冲液(PBS)将划下来的细胞清洗干净，加入不含有血清的细胞培养液，在培养24 h后拍照，实验重复3次，每组设置3个复孔。计算细胞迁移率。

1.4Transwell小室检测细胞侵袭 侵袭实验用8 μm孔径的24孔板Transwell小室进行实验，在实验前48 h取出matrigel放置于冰上融化，按照50 μl/cm2加入Transwell小室，在37℃下孵育30 min。在Transwell小室的上室加入100 μl不含胎牛血清细胞培养液稀释的未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞(细胞悬浮液密度为109个/L)，在下室中加入600 μl含有10%胎牛血清的细胞培养液。培养48 h后将Transwell小室取出，用棉签将没有穿膜的细胞擦掉，PBS洗涤后用4%甲醛固定，吉姆萨染色后在显微镜下观察穿膜的细胞数目，选取5个视野，实验重复3次。

1.5Western印迹检测Six1、N-cadherin、E-cadherin表达 未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞培养48 h后，提取细胞总蛋白(操作步骤参照蛋白提取试剂盒)，采用BCA法对蛋白样品进行定量检测。把蛋白样品加入到5倍上样缓冲液中100℃煮沸5 min。每组蛋白样品取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃转膜90 min，5%脱脂奶粉在室温封闭60 min，依次与一抗和二抗结合后，ECL发光，ChemiDoc XRS成像，Image Lab对蛋白定量并以β-actin为内参。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差。

2 结 果

2.1Six1下调对细胞迁移的影响 未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞迁移率分别为(51.47±5.68)%、(52.69±4.92)%、(21.84±3.54)%。阴性对照组与未转染组相比差异无统计学意义(Pgt;0.05)。siRNA-Six1组与未转染组相比明显降低(Plt;0.05)。

2.2Six1下调对细胞侵袭的影响 未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞侵袭数目分别为(325.84±36.25)个、(324.75±33.55)个、(213.36±24.17)个。阴性对照组与未转染组相比差异无统计学意义(Pgt;0.05)。siRNA-Six1组与未转染组相比明显降低(Plt;0.05)。

2.3N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白表达 未转染组、阴性对照组、siRNA-Six1组细胞Six1蛋白水平分别为0.62±0.04、0.64±0.05、0.25±0.03，N-cadherin蛋白水平分别为1.17±0.15、1.19±0.10、0.85±0.08，E-cadherin蛋白水平分别为0.35±0.03、0.34±0.05、1.10±0.12。阴性对照组N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白水平与未转染组相比差异无统计学意义(Pgt;0.05)。siRNA-Six1组Six1、N-cadherin蛋白水平与未转染组相比明显降低，E-cadherin蛋白水平明显升高(t1=,t2=,t3=,Plt;0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测各组细胞中N-cadherin、E-cadherin、Six1表达

3 讨 论

Six1是胚胎发育过程中的重要调控因子，属于同源盒蛋白家族成员之一，具有促进细胞生长、黏附、迁移等作用〔5〕。成熟的细胞中Six1表达水平下降，而在肿瘤细胞中发现Six1表达上调，其可以通过促进细胞增殖、入侵等导致细胞癌变，该作用已经在子宫癌、乳腺癌、肝癌、大肠癌等多种癌症中得以证实〔6,7〕。Six1基因定位于14q23染色体上，其编码的蛋白可以与DNA结合调控下游靶基因的转录，影响细胞的增殖〔8〕。Six1是一种癌基因，与肿瘤细胞的侵袭、迁移、分化、增殖等有关，正常的乳腺上皮细胞中过表达Six1后可以诱发乳腺癌并且表现出高侵袭性〔9〕。Six1表达下调后的骨肉瘤细胞增殖能力下降，细胞侵袭和迁移能力也明显下降〔10〕。

肿瘤细胞的侵袭和迁移是一个多步骤的复杂过程，也是肿瘤转移的基础。癌细胞扩散首先需要脱离原发病灶，也就是脱离癌细胞之间的黏附，其中E-cadherin发挥重要作用〔11〕。E-cadherin是一个跨膜糖蛋白，分子量为120 kD，为钙黏素家族的成员之一，其在癌症中表达下调，是癌细胞侵袭和迁移能力增加的重要原因〔12〕。N-cadherin是另外一个参与细胞迁移的钙黏素成员，是一种神经钙黏素，其与E-cadherin作用不同，在癌症转移中发挥促进作用〔13〕。

本研究成功构建了Six1下调的甲状腺癌细胞株，提示Six1下调能够抑制甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力，Six1表达降低后能够通过抑制甲状腺癌细胞中N-cadherin表达并促进E-cadherin表达发挥作用。

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10谢柏臻,陈安民,郭风劲,等.RNAi 下调 Six1 基因对人骨肉瘤细胞增殖和转移能力的影响〔J〕.中国癌症杂志,2008;18(8):561-5.

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13Huang H,Svoboda RA,Lazenby AJ,etal.Up-regulation of N-cadherin by collagen I-activated discoidin domain receptor 1 in pancreatic cancer requires the adaptor molecule Shc1〔J〕.J Biol Chem,2016;291(44):23208-23.

〔2017-08-24修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

R736.1

A

1005-9202(2017)21-5243-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.011

河南省科学技术厅科技攻关项目(2009A360015)

罗 方(1978-)，女，硕士，副主任医师，主要从事甲突眼的发病机制研究。