miR-185通过靶向BRCA1抑制三阴乳腺癌细胞的增殖与侵袭

冯 燕 杨 畅 延 文 江 涛

(武汉市第一医院病理科，湖北 武汉 430022)

miR-185通过靶向BRCA1抑制三阴乳腺癌细胞的增殖与侵袭

冯 燕 杨 畅1延 文 江 涛

(武汉市第一医院病理科，湖北 武汉 430022)

目的探讨miR-185是否通过靶向人类乳腺癌易感基因(BRCA)1抑制三阴乳腺癌细胞的生长与侵袭及其抗肿瘤机制。方法采用TargetScan软件预测miR-185靶基因、将野生型或突变型E2F6的3′-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(E2F6-wt或E2F6-mut)并分别与miR-185模拟物(miR-185 mimics)及其无关对照寡核苷酸序列(scramble)、抗miR-185寡核苷酸序列(miR-185-LNA)及其无关对照寡核苷酸序列(control)共转染，荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因E2F6、qRT-PCR检测转染后靶基因的mRNA表达水平、Western印迹检测转染后靶基因的蛋白表达水平。MTS和Transwell验证不同转染后，三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞生长增殖活性和侵袭能力。结果在共转染miR-185 mimics和E2F6-wt、scramble和E2F6-wt两组中，miR-185组荧光素酶活性强度降低了约41.3%(Plt;0.05)。转染miR-185后，E2F6的蛋白和mRNA水平均显著下调，BRCA1的蛋白和mRNA水平均显著上调(Plt;0.05)。在细胞增殖试验中，转染miR-185后，三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长速度显著低于scramble组(Plt;0.05)；与vector组比，BRCA1组可显著抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长(Plt;0.05)，且miR-185+BRCA1组比BRCA1组对细胞生长的抑制作用更加明显(Plt;0.05)。Transwell侵袭实验中，转染miR-185和BRCA1组在36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(100±6)和(100±9)，而对照组即转染scramble和转染vector组穿膜细胞数分别为(210±13)和(180±14)，即miR-185和BRCA1能明显抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的穿膜能力，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论miR-185通过靶向调控BRCA1表达而抑制三阴乳腺癌细胞的生长与侵袭。

三阴乳腺癌；miR-185；人类乳腺癌易感基因1；生长；侵袭

三阴乳腺癌约占所有类型乳腺癌的15%，其显著特征是在年轻乳腺癌患者中高发〔1〕。MicroRNAs(英文简称miRNAs)为内源性非编码的小分子RNA，miRNAs可通过和mRNA的3′-UTR区域的不完全或完全配对，促进mRNA的降解和(或)阻碍其翻译，从而在转录后水平上负调控其表达。细胞的增殖、分化、凋亡、衰老、个体发育等许多的生命活动都受到了miRNAs的调控〔2〕，恶性肿瘤的发生、发展与miRNAs密切相关。据报道，miR-200b在多种恶性肿瘤组织及细胞中表达下调〔3～7〕。miRNA-183、miR-182和miR-96与多种恶性肿瘤的生长增殖和复发转移密切相关〔8〕。有报道称miR-185在胶质瘤的表达显著下调，并可以通过直接靶向DNMT1、RhoA和CDC42基因抑制胶质瘤的增殖和侵袭〔9〕。人类乳腺癌易感基因(BRCA)1是具有遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其基因结构和功能的异常通常与乳腺癌的发生发展密切相关〔10〕。BRCA1是一种抑癌基因，能够抑制多种肿瘤细胞的生长，本研究拟通过证实BRCA1是miR-185调控的靶基因，然后证实miR-185是通过其靶基因BRCA1抑制三阴乳腺癌细胞的增殖与侵袭。

1 材料与方法

1.1主要材料 miR-185模拟物(miR-185 mimics)及无关序列对照(scramble)，锁核酸mir-185-LNA及其对照control购买于Ambion公司。兔单抗人BRCA1、兔抗人E2F6抗体和兔抗人β-actin抗体购买于CAT公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购买于博士德公司(武汉)。si-BRCA1:5′-GGAACCUGUCUCCACAAAGdTdT-3′和si-E2F6:5′-AGGAGACUGGGUAACUUCCTT-3′购买于Invitrogen公司。pcDNA3.1-BRCA1重组质粒(pcDNA3.1-BRCA1)，pcDNA3.1空载体对照(vector)，突变型E2F6的3′-非翻译区(3′-UTR)的荧光素酶报告载体(E2F6-mut)和野生型E2F6的3′-UTR的荧光素酶报告载体(E2F6-wt)由GeneCopoeia公司构建。

双荧光素酶活性检测试剂盒购买于Promega公司，Lipofectamine 2000转染试剂及Trizol购买于Invitrogen公司。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、抗生素(青链霉素混合液,青链霉素混合液100X)购买于Gibco公司。三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)购买于中科院上海生化细胞研究所。蛋白提取试剂盒购买于BestBio公司。化学增强发光法(ECL)发光试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒购于Thermo公司。Transwell的0.8 nm小室和基质胶购买于BD公司，MTS细胞生长增殖/毒性检测试剂盒购买于Sigma公司。

1.2细胞培养 MDA-MB-231细胞培养于含10% FBS，1%青霉素-链霉素溶液(双抗)的DMEM低糖培养基中(Gibco，英潍捷基)，放置于37℃，含5% CO2的细胞培养箱内孵育。MDA-MB-231培养时为单层贴壁生长状态，一般在细胞生长汇合度达到80%～90%时，弃去培养液，用1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，弃去PBS，0.25% 含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，镜下观察，细胞间隙增大时，添加完全培养基中和胰酶，离心，收集细胞，吹打细胞成单细胞悬液，常规传代。

1.3转染miRNA和质粒 收集细胞，用含10% FBS的DMEM培养液稀释，吹打制成(1～5)×104细胞/ml的细胞悬液，6孔板中每孔铺2 ml细胞，置于细胞培养箱中。细胞汇合度60%～80%时准备转染，用无菌EP管配制Lipofectamine 2000和转染试剂(质粒或miRNA)；两者混匀并室温放置20 min。将上述混合物加入到无血清培养液(不含抗生素)中混匀，加入到待转染的6孔中；置于培养箱中，6 h后换成常规培养基。48 h后，收集细胞并抽提蛋白或进行其他实验。

1.4荧光素酶活性检测miR-185靶基因 将实验分成8组：miR-185与E2F6-wt；scramble与E2F6-wt；miR-185与E2F6-mut；scramble与BRCA1-mut；miR-185-LNA与E2F6-wt；control与E2F6-wt；miR-185-LNA与E2F6-mut；control与E2F6-mut；分别共转染上述8组到MDA-MB-231细胞中，48 h后，收集细胞。按照双荧光素酶活性检测试剂盒(Promega，美国)说明书操作，单光子检测仪(Biorad，美国)检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，每组实验设三个复孔。

1.5Western印迹检测三阴乳腺癌细胞中BRCA1和E2F6蛋白表达改变 将实验分4组，miR-185与scramble；BRCA1与vector分别转染到MDA-MB-231细胞，在48 h后提取各组的细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。分别取30 μg样本，进行8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳实验。将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA室温封闭1 h，加入1∶1 500的兔抗人BRCA1抗体和E2F6抗体、1∶1 000兔抗人β-actin抗体，4℃过夜。Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗，室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL发光剂并用X片曝光、显影、定影、扫描并保存条带的图片。Quantity One软件分析，以目的蛋白BRCA1和E2F6条带的灰度值和内参和β-actin的蛋白灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3个复孔。

1.6MTS法检测miR-185和BRCA1对三阴乳腺癌细胞生长增殖活性的影响 将实验分成6组：miR-185与scramble；BRCA1与vector；miR-185+BRCA1与scramble+vector。分别转染到MDA-MB-231中，每组设置6个复孔，在未接种细胞的孔中加入DMEM为调零孔。转染后培养箱培养48 h。随后每孔加入30 μl的MTS试剂，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振荡10 min致使结晶物充分融解。酶标仪测定492 nm波长的OD492值。增殖活性=(处理组-调零孔)/(对照组-调零孔)×100%，每组实验设置3个复孔，对照组为scramble组或vector组。

1.7Transwell侵袭实验 Transwell小室铺加基质胶稀释液，放置4～5 h使其成膜。取100～200 μl细胞稀释液接种于小室的上腔内，下腔中加入500 μl的完全培养基，置于培养箱36 h，取出并用0.1%结晶紫甲醇溶液染色30 min，用棉签擦去上室内细胞，PBS清洗3次，倒置并晾干。在倒置显微镜(OLYMPUS LX71，奥林巴斯)下观察，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，记录实验结果。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1E2F6是miR-185直接调控的靶基因 E2F6是miR-185的靶基因。将野生型或突变型的E2F6的3′-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游，即分别将E2F6-wt或E2F6-mut与miR-185模拟物(miR-185 mimics)以及其无关对照寡核苷酸序列(scramble)、抗miR-185寡核苷酸序列(miR-185-LNA)以及其无关对照寡核苷酸序列(control)共转染到三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中。单光子检测荧光素酶活性，检测结果显示：在共转染E2F6-wt和miR-185 mimics后，荧光素酶活性强度下降了约41.3%，差异有统计学意义(Plt;0.05)；共转染E2F6-wt和miR-185-LNA后，荧光素酶活性强度显著增加。而与E2F6-mut共转染的4组中，荧光素酶的活性强度并无显著差异。见图1。

与scramble、control比较：1)Plt;0.05；下图同图1 TargetScan软件预测和荧光素酶报告载体实验证实E2F6是miR-185直接调控的靶基因

2.2过表达miR-185抑制三阴乳腺癌细胞中基因BRCA1的表达 过表达miR-185时，BRCA1蛋白表达和mRNA表达显著高于scramble组，E2F6的蛋白和mRNA表达水平显著低于scramble组(Plt;0.05，图2A、2B和2C)。而相对于control组，抑制miR-185的表达则显著上调E2F6的蛋白和mRNA表达水平同时降低BRCA1的蛋白和mRNA水平(Plt;0.05，图2A、2B和2C)。另外通过si-RNA干扰E2F6和(或)BRCA1的表达，均可影响BRCA1的表达水平(图2D)。

2.3miR-185可增加BRCA1对MDA-MB-231生长增殖的促进作用 转染BRCA1组的BRCA1蛋白表达水平显著高于vector组(Plt;0.05，图3A)，即转染成功。分别转染miR-185与miR-NC；BRCA1与vector；miR-185+BRCA1与miR-NC+vector到MDA-MB-231细胞，转染48 h后，MTS法检测细胞生长增殖活性。结果显示，转染miR-185组的细胞生长增殖速度显著低于miR-NC组(Plt;0.05，图3B)；与vector组比，BRCA1组可显著抑制MDA-MB-231细胞的生长增殖(Plt;0.05，图3B)，而

图2 过表达miR-185上调人类乳腺癌易感基因1(BRCA1)的表达

与vector比较：1)Plt;0.05；与scramble比较：2)Plt;0.05；与vecstor(pcDNA3.1)比较：3)Plt;0.05图3 MTS证实miR-185可通过BRCA1抑制MDA-MB-231细胞的生长增殖

miR-185+BRCA1组生长增殖速度显著低于BRCA1组(Plt;0.05，图3B)，结果提示过表达BRCA1可能促进miR-185对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长增殖的抑制作用(图3B)。即miR-185可通过间接靶向基因BRCA1表达而抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231生长增殖。

2.4miR-185对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭的影响 Transwell结果显示，转染miR-185的组和转染BRCA1的组，在36 h后，MDA-MB-231细胞穿过基质胶的细胞数量分别为(100±6)和(100±9)，而对照组的细胞数即转染scramble和转染Vector组的细胞数分别为(210±13)和(180±14)，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。即外源性高表达miR-185能抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力，高表达BRCA1能降低乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的侵袭能力。见图4。

图4 Transwell侵袭实验检测过表达miR-185对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的作用

3 讨 论

乳腺癌是在临床上和生物学上具有许多不同类别的一种肿瘤，其具有显著的肿瘤异质性。其中，最具有侵略性的乳腺癌类型为basal-like型即三阴乳腺癌〔11〕。三阴乳腺癌具有高侵袭性，易复发转移，易化疗耐药，且目前缺乏有效的临床治疗手段〔12〕。目前关于miRNA-185在肿瘤中的作用已有部分研究，有报道称miR-185在胶质瘤的表达显著下调，并可以通过直接靶向DNMT1，RhoA和CDC42这三个基因抑制胶质瘤的增殖和侵袭〔13〕。BRCA1是一种抑癌基因，常在乳腺癌和卵巢癌中发生突变，能够抑制多种肿瘤细胞的生长〔14〕。目前关于miR-185和BRCA1在三阴乳腺癌中的作用研究较少，具体机制不明。

本次研究采用多种分子生物学技术来探究miR-185和BRCA1与三阴乳腺癌细胞的增殖与侵袭的关系。生物信息学技术用于预测miR-185的靶基因、荧光素酶报告基因实验检测靶基因活性、qRT-PCR检测靶基因的mRNA表达水平、Western blot检测靶基因的蛋白表达水平。另外也采用MTS和Transwell等实验从功能上验证miR-185通过直接靶向E2F6，间接

上调BRCA1，抑制三阴乳腺癌细胞的生长与侵袭。通过转染miR-185到MDA-MB-231中，本文发现miR-185能显著抑制乳腺癌细胞的生长与增殖。且过表达BRCA1能够进一步促进miR-185对MDA-MB-231的生长增殖的抑制作用。即外源性高表达miR-185能显著抑制三阴乳腺癌细胞的生长与侵袭，即miR-185在三阴乳腺癌中具有潜在的抑癌作用。

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12肖亮生,黄江玲,邱少雄,等.CA153和CEA检测在三阴乳腺癌中的应用价值〔J〕.广东医学,2013;34(13):2029-31.

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〔2017-02-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)21-5257-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.018

1 湖北省第三人民医院呼吸内科

杨 畅(1978-)，男，主治医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

冯 燕(1977-)，女，主治医师，主要从事病理学研究。