游泳耐力运动对小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信号通路的影响

陈 玮 万绍勇 王 炜 龙晓东 陶干臣

(江西中医药大学体育教学部，江西 南昌 330004)

游泳耐力运动对小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信号通路的影响

陈 玮 万绍勇1王 炜1龙晓东1陶干臣1

(江西中医药大学体育教学部，江西 南昌 330004)

目的探讨游泳耐力运动对小鼠骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子2相关酶(SIRT)1信号通路的影响。方法选取SPF级雄性小鼠24只，按照随机数字表法分为对照组和模型组各12只。采用皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸钠注射液建造肌肉衰减综合征小鼠模型，每天0.1 ml/10 g，连续注射6 w。建模成功后再根据随机数字表法将对照组分为正常对照组和耐力运动对照组各6只，模型组分为正常模型组和耐力运动模型组各6只，耐力运动对照组和耐力运动模型组进行相应的游泳耐力运动训练。评价模型组小鼠建模情况。对比小鼠骨骼肌中AMPK mRNA、AMPK蛋白和SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白表达情况。结果模型组小鼠建模成功，小鼠跑台掉下次数显著多于对照组，游泳速度和筋肉含量显著低于对照组(Plt;0.05)。耐力运动模型组小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA均显著高于正常对照组、耐力运动对照组、正常模型组(Plt;0.05)，耐力运动对照组AMPKα2 mRNA高于正常对照组和正常模型组(Plt;0.05)。耐力运动对照组和耐力运动模型组AMPK蛋白均显著高于正常对照组和正常模型组(Plt;0.05)。结论肌肉衰减综合征小鼠筋肉含量减少，运动能力下降，同时游泳耐力训练可增加肌肉衰减综合征小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA水平，同时增加AMPK蛋白水平，其具体机制还有待进一步研究。

游泳耐力运动；骨骼肌；腺苷酸活化蛋白激酶；沉默信息调节因子2相关酶1

肌肉衰减综合征是伴随着年龄增长而出现的进行性骨骼肌量减少、伴有肌肉力量和(或)肌肉功能减退的综合征，以骨骼肌细胞体积和数量减少、结缔组织和脂肪增多为主要特征，患者表现为躯体功能下降、虚弱及不同程度残疾〔1〕。据流行病学调查显示〔2〕，肌肉衰减综合征的多发群体为60岁以上的老年人，当年龄gt;80岁后发病率将逐渐增加，部分地域可达50%。老年人肌肉衰减综合征除引起骨骼肌量减少，力量减弱，运动和平衡能力下降，跌倒风险增加外，还更容易患上糖尿病、关节炎、骨质疏松、心脏病等疾病。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)具有调节脂肪、蛋白质和糖代谢的作用，能维持细胞能量稳态〔3〕。沉默信息调节因子2相关酶(SIRT)1是一种与细胞生长周期调节、胰岛素分泌、 能量代谢、细胞衰老等密切相关的去乙酰化酶，是机体内重要的能量代谢感受器〔4〕。本研究通过对照实验来探讨游泳耐力运动对小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取SPF级雄性小鼠24只，体重27.8～33.4 g，平均(30.4±2.1)g。饲养环境温度保持在20℃～25℃，湿度控制在55%左右，每天给予12 h光照，保持通风，分4笼喂养，每笼6只，正常喂养1 w，期间所有小鼠均自由饮食、饮水。实验小鼠购于南京君科生物工程有限公司。

1.2实验仪器和药品 地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，氯仿、异丙醇(天津市华东试剂厂)，焦碳酸二乙酯、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、一抗、二抗(上海翊圣生物科技有限公司)，裂解液、超敏电化学发光(ECL)试剂盒、Tris盐酸缓冲液(TBST，上海优宁维生物科技公司)。

1.3分组方法和模型建造 在正常饲养1 w后，采用随机数字表法将24只小鼠随机分为对照组(12只)和模型组(12只)。其中对照组小鼠分组后继续正常饮食6 w，不做其他特殊处理。模型组小鼠建模方式如下〔5〕：每天给予皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸钠注射液，0.1 ml/10 g，连续注射6 w。6 w后再根据随机数字表法将对照组分为正常对照组(6只)和耐力运动对照组(6只)，模型组分为正常模型组(6只)和耐力运动模型组(6只)。其中耐力运动对照组和耐力运动模型组均进行游泳耐力运动，无负重，每天训练1 h，每周训练5 d(训练5 d后休息2 d)，共训练6 w，期间正常饮食、饮水。正常对照组和正常模型组不做任何训练，期间正常饮食、饮水。

1.4模型评定标准 在模型组小鼠建模结束后对所有小鼠进行游泳测试和轮式跑台测试，对比对照组和模型组小鼠的游泳速度和从跑台掉下的次数。同时使用小动物体成分分析仪检测所有小鼠的筋肉含量。若建模小鼠的游泳速度、掉下次数和筋肉含量与正常小鼠相比有统计学差异则提示建模成功。同时观察所有小鼠的毛发、精神状态、反应速度、食欲等情况。

1.5mRNA和蛋白的测定方法 在耐力运动对照组和耐力运动模型组小鼠末次训练结束后，所有小鼠禁食12 h后处死，将骨骼肌组织分离，装于标记好的试管中，置入液氮中速冻，后置于-80℃的环境中保存。采用实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)法检测AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA和SIRT1 mRNA的水平。先取部分骨骼肌组织进行研磨，加入Trizol试剂1 ml，震荡摇匀，在4℃下12 000 r/min离心15 min。取其上清液，加入氯仿200 μl，震荡摇匀，直至呈现乳白色，4℃ 12 000 r/min离心15 min， 取其上清液，加入500 μl异丙醇，震荡摇匀，置于0℃ 20 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min。将上清液舍去，加入75%乙醇1 ml，4℃ 12 000 r/min离心15 min，重复一次此步骤。将上清液舍去，于室温中静置5～7 min。加入焦碳酸二乙酯20～30 μl，65℃水浴10 min。PCR引物序列分别为AMPKα1 mRNA上游引物：ACCTGACTCTTTCCTGGACG，下游引物：AATGCCATTTTGCCTTCCGT；AMPKα2 mRNA上游引物：CGCCTCTAGTCCTCCATCAG，下游引物：TTGGGCTTCGTTGTGTTGAG；SIRT1 mRNA上游引物：ACAGTGAGAAAATGCTGGC，下游引物：GCCACTGTCACTGTTACTGC。取部分骨骼肌组织进行研磨，加入裂解液0.35 ml，震荡摇匀，12 000 r/min离心20 min，取其上清液，加入适量BCA工作液，于37℃下干燥30 min。进行凝胶电泳，后转移于聚偏二氟乙烯膜上，10%脱脂奶粉封闭1 h，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。后加入稀释好的二抗，室温孵育二抗1 h，采用TBST缓冲液充分洗涤，后使用超敏ECL试剂盒显影，胶片曝光，扫描定量各信号条带的相对灰度值。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1建模情况 模型组小鼠的跑台掉下次数显著多于对照组，游泳速度和筋肉含量显著低于对照组(Plt;0.05)，说明模型组小鼠建模成功。对照组小鼠毛发有关泽，精神状态良好，运动较多，食欲较强，对外界刺激反应较快，无异常死亡。模型组大鼠毛发杂乱且光泽差，精神状态较差，较少运动，食欲减退，对外界刺激反应较慢，无异常死亡。见表1。

2.2小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表达情况对比 见表2。耐力运动模型组小鼠AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA均显著高于正常对照组、耐力运动对照组、正常模型组(Plt;0.05)，

表1 对照组和模型组小鼠游泳速度、跑台掉下次数和筋肉含量比较

表2 小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表达比较

与正常对照组比较：1)Plt;0.05；与耐力运动对照组比较：2)Plt;0.05；与正常模型组比较：3)Plt;0.05，下表同

耐力运动对照组AMPKα2 mRNA高于正常对照组和正常模型组(Plt;0.05)。耐力运动对照组和耐力运动模型组的AMPK蛋白均显著高于正常对照组和正常模型组(Plt;0.05)。

2.3小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表达对比 耐力运动模型组小鼠SIRT1 mRNA显著高于正常对照组、耐力运动对照组、正常模型组(Plt;0.05)，4组SIRT1蛋白水平两两比较差异均无统计学意义(Pgt;0.05)。见表3。

表3 小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表达比较

3 讨 论

肌肉衰减综合征的具体发病过程复杂多变，细胞凋亡、内分泌因素、蛋白质合成减少、营养不良、炎症反应、线粒体功能障碍等均可能涉及其中。运动和合理饮食是防治肌肉衰减综合征的有效手段，在每天摄入的食物中要注重营养均衡，特别是要加强蛋白质的摄入，同时适当进行简单的抗阻力运动和耐力训练，可有效延缓肌肉衰减综合征的发生〔6〕。AMPK、SIRT1是机体内重要的能量代谢感受器,可感知体内的能量代谢状态,并通过调控下游分子的基因表达或活性来对机体能量代谢过程进行调节〔7〕。有氧运动可直接对骨骼肌造成良性影响，可以增加骨骼肌有氧代谢酶类浓度，提高骨骼肌利用糖、脂肪的代谢能力，同时提高脂肪供能的比例，有氧运动还可以使得肌细胞内线粒体的数量和体积得到增加。通过运动可激活骨骼肌AMPK/SIRT1信号通路，提升线粒体氧化能力和生物合成能力提，进而改善骨骼肌肌肉质量〔8〕。

本研究结果提示模型组小鼠建模成功，同时患有肌肉衰减综合征的小鼠筋肉含量下降，运动能力减退，进而对身体各项机能造成影响，包括食欲减退、营养不良、反应速度变慢等。另外说明游泳耐力运动可以提升小鼠骨骼肌AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA的水平，同时可以提高小鼠骨骼肌AMPK蛋白水平。AMPK在真核细胞生物中广泛存在,能感知细胞能量代谢状态的改变,并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡〔9〕。SIRT1与细胞的能量代谢同样存在着密切的关系，当热量限制时，SIRT1水平升高,进而延长生物体的衰老过程〔10〕。研究表明〔11〕，AMPK与SIRT1可能存在着内在联系,从而在调节能量代谢过程中起着重要的调控作用。AMPK是一种异源三聚体蛋白，有AMPKα、AMPKβ、AMPKγ 3个亚型，其中AMPKα又可分为AMPKα1、AMPKα2，骨骼肌纤维中以AMPKα2为主要表现形式。当小鼠在进行游泳耐力运动时，AMPK可受到多种信号通路的刺激，同时丝氨酸-苏氨酸激酶11可激活AMPK，肌纤维收缩时可促进钙离子释放，均能使AMPK表达增加，此外AMPK可激活SIRT1，提高SIRT1活性〔12〕。有研究结果显示〔13〕，骨骼肌的衰老与线粒体的数量和活性存在相关性，小鼠在进行游泳耐力运动时需要消耗大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，这就需要提升线粒体的数量和活性，在运动时机体应激激活骨骼肌AMPK/SIRT1信号通路，促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子(PGC)-1α表达，同时提高PGC-1α的活性，提升线粒体的氧化磷酸化功能，进而增加ATP的合成，满足机体的供能需求。

1熊伟平,夏 志.有氧运动促进老年前期小鼠快缩型骨骼肌蛋白质合成代谢的研究〔J〕.中国康复医学杂志,2016;31(12):1311-7.

2韩佩佩,郭 琪,潘 翔,等.老年人肌肉衰减综合征的诊断标准与运动疗法〔J〕.中国康复医学杂志,2015;30(3):290-4.

3Hu M,Liu B.Retraction notice to:resveratrol attenuates lipopolysaccharide-induced dysfunction of blood-brain barrier in endothelial cells via AMPK activation〔J〕.Korean J Physiol Pharmacol,2017;21(2):277.

4周 蓉,王奇敏,张 成,等.大鼠脑干在不同低氧状态下沉默信息调节因子2相关酶1水平检测及其意义〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2014;37(5):352-5.

5鲁飞翔,李 军,周仙杰,等.地塞米松致小鼠肌肉衰减综合征模型建立〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(22):5542-4.

6黄金贤,罗佳妮,刘培庆,等.AMPK/PPARα/SCAD信号途径对心肌肥大的调控研究〔J〕.中国病理生理杂志,2014;30(5):769-78.

7金 鑫,张会欣,张彦芬,等.津力达对高脂诱导的胰岛素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌甘油三酯相关酶的影响〔J〕.中国实验动物学报,2015;23(1):69-74.

8杨 艳.补充白刺多糖联合有氧运动对衰老大鼠心肌和骨骼肌的保护作用〔J〕.西南师范大学学报(自然科学版),2016;41(9):11-6.

9张 坦,崔 迪,张 喆,等.游泳运动对糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎症信号通路的影响〔J〕.体育科学,2016;36(9):40-7.

10Lin N,Li XY,Zhang HM,etal.microRNA-199a-5p mediates high glucose-induced reactive oxygen species production and apoptosis in INS-1 pancreatic β-cells by targeting SIRT1〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017;21(5):1091-8.

11李 格,张 缨.低氧训练诱导AMPK对小鼠骨骼肌PPARα表达的影响〔J〕.山东体育学院学报,2013;29(5):40-6.

12Han JY,Lee S,Yang JH,etal.Korean red ginseng attenuates ethanol-induced steatosis and oxidative stress via AMPK/Sirt1 activation〔J〕.J Ginseng Res,2015;39(2):105-15.

13赵永才.运动干预骨骼肌、心肌线粒体动力学研究现状——心肌线粒体动力学研究展望〔J〕.体育科学,2016;36(11):75-81,96.

〔2017-03-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R39

A

1005-9202(2017)21-5231-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.006

江西省教育厅科学技术青年项目(No.GJJ160754)

1 井冈山大学体育学院

万绍勇(1981-)，男，硕士，副教授，主要从事运动训练与康复研究。

陈 玮(1981-)，男，硕士，讲师，主要从事运动训练与康复研究。