血红素氧合酶-1对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

苏 健 徐 冰 王 婧 刘学政

(锦州医科大学人体解剖学教研室，辽宁 锦州 121001)

·基础研究·

血红素氧合酶-1对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

苏 健 徐 冰1王 婧1刘学政

(锦州医科大学人体解剖学教研室，辽宁 锦州 121001)

目的探讨血红素氧合酶(HO)-1对糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGC)保护作用及其机制。方法清洁级雄性SD大鼠24只中8只为对照组，余16只腹腔注射链脲佐菌素制作DM大鼠模型，将血糖浓度大于16.7 mmol/L的大鼠定为DM模型，随机分为DM组8只，另外8只腹腔注射HO-1特异性诱导剂正铁血红素为实验组，对照组及DM组腹腔注射等剂量生理盐水。12 w后，HE染色观察RGC密度，硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量，氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫组化染色和Western印迹法检测视网膜HO-1、Caspase-3表达情况。结果与对照组相比，DM组RGC密度显著降低(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。与对照组相比，DM组MDA含量明显升高、SOD活性明显降低(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。HO-1在对照组仅微量表达于内核层，DM组阳性表达在节细胞层及内核层有所增加，而实验组阳性染色显著增加，特别是节细胞层。Caspase-3在对照组视网膜几乎无表达，而DM组阳性表达显著增多，主要分布于节细胞层及内核层，实验组与DM组相比阳性表达有所减弱。与对照组相比，HO-1在DM组及实验组蛋白表达量均增加(Plt;0.01)，且实验组增加更明显(Plt;0.05)；与对照组相比，Caspase-3在DM组蛋白表达显著增加(Plt;0.01)，而实验组无明显变化。结论通过正铁血红素诱导HO-1在视网膜的高表达，下调了DM大鼠视网膜Caspase-3的表达，抑制了氧化应激，恢复了视网膜RGC密度；提示HO-1可能对DM大鼠RGC具有保护作用。

糖尿病视网膜病变；血红素氧合酶-1；视网膜神经节细胞；Caspase-3

糖尿病(DM)视网膜病变(DR)发病率逐年升高，研究发现视网膜神经元凋亡和功能障碍是视力降低的重要因素〔1〕。视网膜神经节细胞(RGC)轴突是构成视神经的主体，RGC受损甚至凋亡是DR的重要机制之一〔2〕。血红素氧合酶(HO)-1是一种抗氧化酶，可以通过将血红素分解为胆绿素、一氧化碳(CO)等代谢产物发挥强大的抗氧化、抗凋亡等作用被广泛应用于眼科疾病的研究〔3〕。利用钴原卟啉(CoPP，一种强有力的HO-1诱导剂)处理视神经受压的小鼠，可以使因轴突损伤导致的RGC密度增加〔4〕。在链脲佐菌素(STZ)诱导的DM大鼠中，HO-1能够减缓RGC的进一步损害，但具体机制不清〔5〕。本研究拟探讨HO-1对DM大鼠RGC的保护作用及其机制。

1 资料与方法

1.1实验动物和主要试剂、仪器 24只清洁级雄性SD大鼠购自锦州医科大学实验动物中心，体质量200～240 g。STZ及正铁血红素购自美国Sigma公司；HO-1、Caspase-3抗体购自Abcam公司；Western印迹二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。免疫组织化学试剂盒、HE染色试剂盒、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒均购自中国武汉博士德生物工程有限公司。主要仪器为美国强生公司血糖仪，日本Olympus公司荧光倒置显微镜，德国SLEE公司冰冻切片机，美国Azure凝胶成像系统，美国伯乐垂直电泳仪，中国赛默飞酶标仪。

1.2实验动物分组及模型的制备 大鼠随机分成对照组、DM组、实验组各8只。DM组及实验组禁食水12 h后，按55 mg/kg腹腔一次性注射1.5%STZ(0.1 mol/L、pH4.5的柠檬酸缓冲液配制)，72 h后采尾静脉血测血糖，血糖浓度gt;16.7 mmol/L的大鼠定为DM模型。对照组给予等剂量柠檬酸缓冲液。DM模型制备完成后，实验组给予HO-1特异性诱导剂正铁血红素，腹腔注射剂量为20 mg/kg，1次/d，对照组、DM组给予等剂量生理盐水，连续注射12 w。

1.3样本制备 12 w后，每组取4只，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)将大鼠麻醉。打开大鼠胸腔，先用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)将血液冲洗干净，再用4%多聚甲醛经心脏灌流固定。固定后用眼科剪取出眼球(1只用于HE染色，1只用于免疫组化)于多聚甲醛固定液中，4℃保存备用。另取4只水合氯醛深度麻醉，取双侧眼球，解剖显微镜下分离视网膜(冰上操作)置于1.5 ml离心管中，称重后加入中效蛋白裂解液，冰上剪碎，4℃离心机30 min后取上清，-20℃保存备用，用于Western印迹及MDA含量及SOD活性检测。

1.4RGC密度检测 视网膜HE染色，将固定于多聚甲醛中眼球取出后放入20%蔗糖溶液4℃过夜脱水至眼球沉底。冰冻切片机沿冠状面切片，厚度为12 μm。切片以 PBS 漂洗3 min×3 次，苏木素染色4 min，自来水冲洗2 min×3次，PBS 洗3 min×3次，1%盐酸乙醇浸泡2 s，自来水冲洗2 min×3次，伊红浸染切片2 min，以 PBS 洗3 min×3次。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，倒置显微镜观察，每张切片取3个视野。

1.5免疫组织化学检测大鼠视网膜HO-1、Caspase-3表达 冰冻切片置于PBS中洗5 min×3 次，30%H2O2室温30 min，蒸馏水洗5 min×2次，10%山羊血清室温20 min，甩去多余液体，不洗，切片滴加一抗(HO-1，1∶400；Caspase-3，1∶500)，4℃湿盒过夜。PBS洗10 min×3次，滴加生物素标记的二抗，室温2 h。PBS洗10 min×3次，加亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)室温30 min，PBS洗10 min×4次。二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下控制反应时间，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，倒置显微镜观察。

1.6Western印迹检测大鼠视网膜HO-1、Caspase-3表达 二辛可酸(BCA)法测蛋白浓度并制样。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(兔抗大鼠HO-1、 Caspase-3，均为1∶10 000 和兔抗大鼠β-actin，1∶2 500)，在4℃冰箱震荡过夜，Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)洗10 min×3次，加入二抗(用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，1∶5 000)室温震荡2 h。TBST洗10 min×3次。Western印迹试剂盒显色，以β-actin为内对照，检测HO-1、Caspase-3蛋白相对表达量。

1.7MDA含量及SOD活性检测 用4℃生理盐水制备5%的视网膜匀浆，5 000 r/min离心 15 min，取上清，MDA的检测采用硫代巴比妥酸法；SOD活性检测应用氮蓝四唑光化还原法。按试剂盒的步骤进行，根据公式分别计算视网膜组织上清的MDA含量及SOD活性。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用SNK检验。

2 结 果

2.1各组MDA含量及SOD活结果 对照组、DM组及实验组MDA含量分别为(3.65± 0.49)、(7.50± 0.39)、(4.66±0.08)nmol/mg，3组有统计学差异(F=89.21，Plt;0.01)。与对照组相比，DM组MDA含量明显升高(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。对照组、DM组及实验组SOD活性分别为(85.31± 0.29)、(45.69± 0.60)、(84.88± 0.05)U/mg。3组有统计学差异(F=10 572.91，Plt;0.01)。与对照组相比，DM组SOD活性明显降低(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。

2.2各组RGC密度比较 对照组、DM组及实验组RGC密度分别为(462.67±23.63)、(350.00±19.31)、(465.33±23.67)mm-2，3组有统计学差异(F=26.15，Plt;0.01)。与对照组相比，DM组RGC密度明显降低(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。见图1。

图1 3组视网膜RGC密度HE染色(箭头示RGC，×400)

2.3各组HO-1、Caspase-3在视网膜的表达 HO-1在对照组仅微量表达于内核层(INL)，DM组阳性表达在神经节细胞层(GCL)及INL有所增加，而实验组阳性染色显著增加，特别是GCL。Caspase-3在对照组视网膜几乎无表达，而DM组阳性表达显著增多，主要分布于GCL及INL，实验组与DM组相比阳性表达有所减弱。见图2。

2.4各组HO-1、Caspase-3蛋白表达 对照组、DM组、实验组HO-1蛋白相对表达量分别为(4.58±0.02)%、(8.32±0.13)%、(15.45±0.32)%，3组有统计学差异(F=2 277.78,Plt;0.01)。与对照组相比，DM组及实验组蛋白表达量均显著增加(Plt;0.01)，且实验组增加更显著(Plt;0.05)。对照组、DM组、实验组Caspase-3蛋白的相对表达量分别为(1.60±0.32)%、(7.19± 0.05)%、(1.88±0.22)%，3组有统计学差异(F=589.52,Plt;0.01)；与对照组相比，DM组蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(Plt;0.01)，而实验组无明显变化(Pgt;0.05)。见图3。

图2 免疫组织化学检测HO-1及Caspase-3在各组视网膜的表达(箭头示阳性表达，×400)

图3 Western印迹检测3组HO-1、Caspase-3蛋白相对表达量

3 讨 论

DR全球患病率不断攀升，成为世界上成年人失明的主要原因〔6〕。RGC轴突构成视神经，为视觉传导通路的枢纽〔7〕。研究表明，RGC在DR早期凋亡增加，其数量的变化对DR的发生发展具有重要影响〔8〕。

HO作为血红素分解的限速酶，共有3种亚型，HO-1、 HO-2 和 HO-3。目前研究最多的是HO-1，其在眼的视网膜、晶状体广泛分布，可被自身反应底物hemin所诱导，与细胞抗氧化应激损伤关系密切〔9〕。研究发现，正铁血红素诱导DM视网膜高表达HO-1可以通过抗炎、抗凋亡和抗增殖作用从而保护RGC〔10〕。国内文献也证实，HO-1因其具有抗氧化、抗凋亡作用而对DM大鼠视网膜神经元及血管内皮细胞具有保护作用〔11〕。但对RGC的保护作用及其机制尚不完全清楚。本研究提示DR时高血糖可能诱发DM大鼠视网膜氧化应激损伤，从而导致抗氧化蛋白HO-1的增加；HO-1表达的上调可能对RGC起到了一定的保护作用。

近年来，氧化应激损伤在RGC凋亡中的作用越来越受到关注〔12,13〕。氧化应激是指体内自由基生成过多，氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，从而导致组织细胞损伤。MDA 是自由基脂质过氧化代谢产物，SOD是自由基清除剂。MDA含量升高，SOD活性降低，可间接反映组织细胞氧化应激程度〔14〕。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，是细胞凋亡的一个特异性标志物，在RGC凋亡时表达上调〔15〕。本文结果提示DM时视网膜处于氧化应激状态，Caspase-3参与了视网膜细胞凋亡过程。HO-1可能通过降低视网膜氧化应激水平，抑制了RGC凋亡，从而使受损凋亡的RGC恢复。

综上，通过正铁血红素诱导HO-1在视网膜高表达，下调了DM大鼠视网膜Caspase-3的表达，抑制了氧化应激，恢复了RGC密度，提示HO-1可能对DM大鼠RGC具有保护作用。但因DR发病机制复杂，HO-1对DR的影响还有待探讨。

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〔2016-03-19修回〕

(编辑 苑云杰)

Protectiveeffectofhemeoxygenase-1onretinalganglioncellsindiabeticrats

SUJian,XUBing,WANGJing,etal.

AnatomyTeachingandResearchSection,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,Liaoning,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and its mechanism of heme oxygenase(HO)-1 on retinal ganglion cells (RGC) in diabetic rats.Methods24 clean grade male SD rats, including 8 rats served as control group, the other 16 rats were given intraperitoneal injection of streptozotocin to establish diabetic rats model. The rats with blood glucose concentrationgt;16.7 mmol/L as diabetic models were randomly divided into 2 groups: 8 ones as diabetic group, another 8 intraperitoneal injection of HO-1 specific inducer of panhematin (hemin) as experimental group, control group and diabetes group were given intraperitoneal injection of saline. After 12 weeks, the RGC density was observed by HE staining. MDA content was detected by thiobarbituric acid. SOD activity was detected by Photoreduction of nitrogen blue four triazole. The expressions of retinal HO-1 and Caspase-3 were detected by immunohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with the control group, the RGC density in diabetic group was significantly decreased (Plt;0.01), but there was no significant change in experimental group (Pgt;0.05). Compared with control group, content of MDA increased and activity of SOD decreased significantly in diabetic group (allPlt;0.01), but there was no obvious change in experimental group (allPgt;0.05). The trace HO-1 expressed in the kernel layer in control group, positive HO-1 expression increased in ganglion cell layer and kernel layer in diabetes group, while the experimental group positive staining increased significantly, especially in ganglion cell layer. The expression of Caspase-3 in control group was almost saw, but the positive expression of Caspase-3 increased significantly in diabetes group, mainly distributed in ganglion cell layer and inner nuclear layer, and the positive expression of Caspase-3 in experimental group was weakened compared with that of diabetic group. Compared with control group, the expression of HO-1 protein in diabetic group and experimental group were obviously increased (Plt;0.01), especially experimental group. Compared to control group, the expression of Caspase-3 protein was significantly increased in diabetic group (Plt;0.01), while the experimental group had no obvious change.ConclusionsThe high expression of HO-1 in the retina induced by hemin could down regulate the expression of Caspase-3 in the retina of diabetic rats, inhibit oxidative stress and restore the retinal RGC density. HO-1 may protect RGC of diabetic rats.

Diabetic retinopathy; Heme oxygenase-1; Retinal ganglion cells; Caspase-3

R587.1

A

1005-9202(2017)21-5217-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.001

国家自然科学基金资助项目(No.81571383)

1 锦州医科大学附属第三医院检验科

刘学政(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事糖尿病视网膜病变研究。

苏 健(1970-)，男，硕士在读，主治医师，主要从事糖尿病视网膜病变研究。