均匀设计法优化黔产铁皮石斛多糖热水浸提工艺

单冰冰，陈 宽，李 婷，张建永，黄厚今

(1.遵义医学院 药学院药物分析教研室,贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 公共卫生学院毒理学教研室,贵州 遵义 563099)

均匀设计法优化黔产铁皮石斛多糖热水浸提工艺

单冰冰1，陈 宽1，李 婷1，张建永1，黄厚今2

(1.遵义医学院 药学院药物分析教研室,贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 公共卫生学院毒理学教研室,贵州 遵义 563099)

目的采用均匀设计法优化黔产铁皮石斛多糖热水浸提工艺参数，为其多糖资源开发利用提供参考。方法首先在建立多糖含量测定方法并进行验证的基础上，以黔产铁皮石斛多糖提取率为评价指标，以提取时间和提取温度和水料比为因素，按照均匀设计优化提取工艺。结果建立黔产铁皮石斛多糖的含量测定方法，同时优化的铁皮石斛热水浸提最佳条件：提取时间78.5 min，提取温度90℃，水料比为70∶1(mL/g)，提取2次。样品多糖提取率实测平均值41.31%与预测值42.32%相差较小，重复性好。结论本研究优化的提取工艺，稳定可行，可用于黔产铁皮石斛多糖的热水浸提。

铁皮石斛；多糖；提取工艺优化；均匀设计

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干燥茎[1]，具有益胃生津、滋阴清热等功效，现代研究发现其具有免疫力调节、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、促消化等药理作用[2 ]，众多文献报道其主要有效成分为多糖[3]，因此多糖的提取是充分利用铁皮石斛的重要环节之一[4]。目前铁皮石斛多糖的提取工艺主要有热水浸提法、加热回流法、超声提取法、微波提取法、酶提法[5]等，各个方法的提取率相差较大且结论不一，原因可能是不同地区的铁皮石斛多糖成分不同，多糖中的单糖比例存在差异，推测与其种质遗传差异相关[6-7]。贵州地处云贵高原多山地，虽与浙江都在北纬30度附近，但黔产铁皮石斛多为引种栽培，主要在黔西南州和黔南州，其他也有散在基地种植。不同的种植环境导致黔产铁皮石斛质量可能与其他产地铁皮石斛存在一定差异，研究发现浙江铁皮石斛多糖含量最高(47.90%)，其次为广东与广西(42.84%、42.32%)[8]，目前贵州产铁皮多糖石斛含量相对较低，有报道贵州独山的铁皮石斛多糖含量为18.20%[9]。推测可能与栽培方式不同有关，盆栽模式、大棚栽培、岩石栽培、野生贴树栽培的铁皮石斛多糖含量差异在10%左右[10]。另外黔产铁皮石斛多糖含量较低可能与其提取方法及工艺尚未优化有关，采用药典及其他产区的方法可能致提取不完全。

因此有必要对黔产铁皮石斛多糖提取工艺进行考察，提高铁皮石斛利用率,为药材深加工提高必要保障。

均匀设计是方开泰将数论和多元统计相结合创造的一种适用于多因素多水平的实验设计方法，具有实验次数少、均匀分散、实验数据用计算机处理和方便、迅速、准确的特点，可使实验点具有更好的代表性[11]。其常规分析多先进行单因素实验再进行设计法优化需花费较多时间，前后测量之间存在时间间隔，易带来较大外来影响，对实验造成误差。本研究结合文献[12-14]和预实验结果将均匀设计直接运用于黔产铁皮石斛多糖提取效果影响因素中，优选黔产铁皮石斛多糖热水浸提工艺条件，以期为黔产铁皮石斛多糖的开发利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HH-6数显恒温水浴锅(上海上登实验设备有限公司)；FW135型中药材粉碎机(天津泰斯特公司)；冷冻离心机(上海安亭分析仪器有限责任公司)；Spectra Max Plus 384全波长酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)。

1.2 材料 实验用铁皮石斛由贵州省福泰来科技有限公司提供，经遵义医学院药学院聂绪强博士鉴定为铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干条；无水乙醇(批号：20160201，重庆川东化工有限公司)；苯酚(批号：P100762，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；37%浓硫酸(批号：20130314，国药集团化学试剂有限公司)；葡萄糖对照品(批号：0833-9501中国药品生物制品检定所)；双蒸水。

2 方法

2.1 多糖的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 参照2015版《中国药典》一部中铁皮石斛含量测定项下对照品溶液的制备以无水葡萄糖为对照品，精密称取无水葡萄糖对照品约14 mg，加水溶液稀释成每1毫升含140 μg的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 铁皮石斛粉碎成粉末过60目筛，精密称取其约0.3 g，按提取时间78.5 min、提取温度90℃、水料比70∶1(mL/g)、热水浸提2次，合并提取液，定容置100 mL量瓶中，4 ℃、2550×g下离心10 min去渣，上清液加5倍体积80%乙醇4℃沉淀1 h，4 ℃、2550×g下离心15 min，沉淀用4倍体积80%乙醇洗涤两次，离心得铁皮石斛粗多糖沉淀，沉淀以双蒸水溶解至10 mL量瓶中，得供试品溶液。

2.1.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置5 mL具塞试管中，各加水补至0.5 mL，精密加入5%苯酚溶液0.5 mL，混匀，硫酸溶液2.5 mL，混匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰水浴中冷却5 min取出，以相应试剂为空白。使用酶标仪在488 nm波长处测定吸光值。

2.1.4 测定方法 精密量取供试品溶液0.5 mL，置10 mL具塞试管中，按“2.1.3”线性关系考察的建立项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液2.5 mL”起，依法测定吸光值，从标准曲线上读出供试品溶液中的粗多糖浓度，计算提取率，公式如下：提取率%= (C×V1×V2)/ (m×1000)×100%；C：粗多糖浓度mg/mL；V1：提取后定容的体积mL；V2：粗多糖定容的体积mL；m：铁皮石斛质量g。

2.1.5 精密度试验 精密吸取葡萄糖对照品溶液6份，每份0.5 mL，按照“2.1.3”项下的方法处理并测定吸光值。

2.1.6 重复性试验 按照“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.3” 项下的方法处理并测定吸光值。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温下放置，分别于5、10、30、60、90、120、180、240 min后按“2.1.3”项下的方法处理并测定吸光值。

2.1.8 加样回收率试验 按照“2.1.2” 项下方法，取0.15 g的已知含量的铁皮石斛，平行制备6份供试品溶液，分别加入一定量的葡萄糖对照品溶液(浓度：140 μg/mL)，按“2.1.3”项下的方法测定吸光值，计算回收率及其RSD值。

2.2 热水浸提铁皮石斛多糖的工艺流程 铁皮石斛粉碎成粉末过60目筛，精密称取其约0.3 g，采用热水浸提法，提取液处理方法同“2.1.2”。

2.3 热水浸提工艺优选 本研究主要对热水浸提工艺部分采用均匀设计进行优化。因素与水平：采用3因素6水平，考察提取时间(A)、提取温度(B)、水料比(C)，水平见表1。以多糖收率为评价指标，筛选铁皮石斛热水浸提多糖的最佳条件，每个试验重复处理3次取平均值。

表1因素水平表

水平A/提取时间/minB/提取温度/℃C/水料比/倍1304020245503036060404757050590806061059070

3 结果

3.1 多糖的含量测定

3.1.1 线性关系考察 以葡萄糖浓度为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，回归方程为Y= 0.1437X- 0.0147，R2= 0.999，表明葡萄糖浓度在28 ～ 140 μg/mL范围内线性关系良好。

3.1.2 精密度、重复性、稳定性试验 根据各测定结果计算，精密度、重复性、稳定性的RSD值分别为0.08%、3.79%、3.07%，表明本方法精密度良好，重复性良好，同时表明供试品溶液在240 min内稳定性良好。

3.1.3 加样回收率试验 将“2.1.8”项下加样回收率供试品溶液进行测定和计算，结果见表2。

表2多糖加样回收率试验

供试品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.09990.10000.198898.940.09990.10000.198298.310.09990.10000.196596.5798.632.550.10000.10000.196296.220.09980.10000.2030103.240.09880.10000.198398.53

3.2 热水浸提铁皮石斛多糖的工艺

3.2.1 均匀设计试验结果 均匀设计试验安排与试验结果见表3。

表3均匀设计试验安排与试验结果

序号因素ABC提取率(%)190607039.86275502035.24345405038.014105804033.72560906038.87630703032.01

3.2.2 均匀设计回归分析 以各因素为自变量，以铁皮石斛多糖提取率为因变量，用DPSV7.05数据处理系统进行二项式逐步回归分析，得到回归方程为：Y=0.521687164-0.003715476190B-0.0024519979296C+0.00006469565217BC，方差结果见表4。

表4二次多项式逐步回归法处理的数据结果

因素偏相关tPB-0.98899.41090.0025C-0.96355.09230.0146BC0.98598.32190.0036

相关系数R= 0.996 8，F值 = 105.270 6，显著水平P= 0.009 4，剩余标准差S= 0.003 9，说明该方程能很好的拟合热水浸提铁皮石斛多糖的过程。由回归方程可知，温度和水料比对多糖提取有一定的影响，提取时间对多糖提取的影响较小，二次多项式逐步回归法可得到最高指标时各个因素组合为，热水浸提时间78.5 min，温度90 ℃，水料比70∶1，提取率为42.32%。

3.2.3 优选工艺条件的验证试验 将铁皮石斛粉碎成粉末过60目筛，精密称取其约0.3 g，加70倍水以90 ℃热水浸提78.5 min，提取2次，进行验证，结果见表5，3次实验相对标准偏差小于2%，验证提取率41.31%与均匀设计试验预测提取率42.32%接近，表明该提取工艺模型准确，稳定可行。

表5验证试验结果

序号验证提取率(%)RSD(%)预测提取率(%)141.16241.620.6642.32341.14

3.2.4 提取次数的考察 铁皮石斛粉碎成粉末过60目筛，精密称取约0.3 g，按上述条件分别提取1、2、3、4次，每个试验重复处理3次取平均值，结果见表6。提取1次时收率最低，可能是提取不完全，提取2、3、4次的收率相差不大，提取2次的相对标准偏差最小，结合实际生产中能耗节约等原则，选择提取次数为2次。

表6提取次数试验结果

提取次数平均提取率(%)RSD(%)137.887.07241.410.66341.402.60442.983.36

4 讨论

本研究首先建立了黔产铁皮石斛的多糖含量测定方法，进而采用均匀设计优化了热水浸提工艺，结果经过优化提取2次后，多糖提取率41.41%，且工艺稳定简单。

常规测量铁皮石斛多糖，采用硫酸-苯酚法以紫外分光光度计完成，测试费时且须清洗比色皿。本实验采用酶标法同时检测多样本，测定样品仅需几百微升液体，测量时可避免试剂、原料的浪费，短时间内同时测多个样品，操作简便快捷，减少仪器和外界环境干扰，使结果准确性稳定性更好[15-16]。

目前铁皮石斛多糖提取工艺的研究较多，多采用单因素复合正交设计或响应面设计方法。提取方法多以热水浸提为主，如王培培等[12]采用正交实验方法优化多糖提取工艺水液比为40∶1、浸提温度70 ℃、浸提时间2 h、浸提2次，提取率31.9%。王琳等[13]采用响应面法优化多糖提取工艺，水料比为31.28∶1、醇沉浓度95.42%、提取时间3 h、提取3次，提取率30.83%。然而上述方法存在工作量大、试验次数多、时间间隔久等特点。本研究采用均匀设计可使试验次数极大减少，同时优化的范围较宽，利于以后的中试放大。在试验中，本文结合文献报道采用了3因素6水平方法，考察提取时间(A)、提取温度(B)、水料比(C)三个主要因素，水平数高于文献中正交设计的3水平[12]，数据采用二项式逐步回归分析处理得回归方程并进行分析，建立各因素与评价指标间的数学模型，结果发现温度和水料比对黔产铁皮石斛收率影响较大，优化出了最优条件。验证试验表明均匀设计用于黔产铁皮石斛多糖提取，验证值与理论值很接近，并通过方法学验证，说明采用均匀设计和二次多项式回归分析得到的试验因素的方法可行。

最终得出铁皮石斛多糖的最佳提取条件:70倍水，90 ℃热水浸提78.5 min，提取2次。结果发现黔产铁皮石斛的得率在41.41%，多糖提取的各因素重要程度依次为提取温度gt;水料比gt;提取时间，虽然各因素重要程度与文献中云南产铁皮石斛多糖提取因素一致：提取温度gt;水料比gt;提取时间[14]，但具体的水提倍数、提取时间相差较大，所以本提取工艺可能更适合黔产铁皮石斛多糖的提取。

综上所述，均匀设计优化对黔产铁皮石斛多糖提取工艺并采用酶标仪检测其含量是一种操作简单、方便的方法，且工艺稳定可行，对于优化不同产区的铁皮石斛多糖提取工艺具有指导意义。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2015:282-283.

[2] 刘亚娟,王诗豪,张铭,等.铁皮石斛多糖抗癌及免疫活化研究[J].广州化工,2014,42(10):58-65.

[3] 朱启发,黄娇丽.铁皮石斛产品开发研究进展[J].现代农业科技,2015,9(9):70-71.

[4] 岑忠用,苏江,梁冠兴.热水浸提法提取铁皮石斛原球茎多糖的工艺[J].湖北农业科学,2011,50(18):3807-3810.

[5] 胡贤春,郭永兵,向劲松,等.铁皮石斛多糖的研究进展[J].安徽农业科学,2015,27(15):78-80.

[6] 龚庆芳,周浩,王新桂.不同产地铁皮石斛的品质比较研究[J].北方园艺,2013(8):162 -165.

[7] 肖正航.铁皮石斛种质资源遗传多样性HPLC指纹图谱分[D].福州:福建农林大学,2013:25 -26.

[8] 刘文杰.铁皮石斛的红外光谱定性定量研究[D].北京:北京中医药大学,2014:50-51.

[9] 李满飞,徐国钧,平田正,等.中药石斛类多糖的含量测定[J].中草药,1990,21(10):10-12.

[10]罗在柒,杨洋,吴仕艳.不同栽培方式铁皮石斛的质量与品质分析[J].贵州林业科技,2016,44(3):14-18.

[11]方开泰,王元.数论方法在统计中的应用[M].北京:科学出版社,1996:5-36.

[12]王培培,鲁芹飞,陈建南,等.正交实验法优化铁皮石斛多糖的提取工艺[J].时珍国医国药,2012,23(11):2781-2782.

[13]王琳,李巧玉,杨丹,等.响应曲面法优化铁皮石斛鲜条多糖提取工艺[J].浙江农业科学,2016,57(9):1473-1477.

[14]黄晓君,聂少平,王玉婷,等.铁皮石斛多糖提取工艺优化及其成分分析[J].食品科学,2013,34(22):21-26.

[15]赵艳,毕荣宇,牟德华.利用酶标仪测定6种食用菌中多糖含量 [J].食用菌,2013,35(1):59-61.

[16]赵福坤,吴芹,陆远福,等.金钗石斛总生物碱提取及含量测定方法的改进 [J].遵义医学院学报,2015,38(5):533-535.

[收稿2017-06-30;修回2017-08-26]

(编辑：王福军)

综述

OptimizationofhotwaterextractionforpolysaccharidesinDendrobiumofficinaleKimuraetMigofromGuizhoubyuniformdesign

ShanBingbing1,Chenkuan1,LiTing1,ZhangJianyong1,HuangHoujin2

(1.Department of Pharmacy,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Toxicology,School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo optimize the hot water extraction of polysaccharides in Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou in order to provide reference for the development and utilization.MethodsFirstly,a method for determination of polysaccharide content was tested.The extraction time,temperature and ratio of water to material in extraction process were optimized by uniform design based on the yield of polysaccharides of Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou.ResultsThe content determination method of polysaccharides was established.The optimization of hot water extraction conditions were 78.5 min,90℃,70∶1 (ml/g) ratio of water to Dendrobium officinale Kimura et Migo and for 2 times.The extraction rate of polysaccharide was 41.31%,less than the predicted value 42.32%,but it exhibited good repeatability.ConclusionThe optimized extraction process is stable and feasible and could be used for hot water extraction of polysaccharides Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Dendrobium officinale Kimura et Migo; polysaccharide; optimization of extraction; uniform design

贵州省科技重大专项(NO：黔科合重大专项字[2015]6010)。

张建永，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药质量评价,E-mail:zhangjianyong2006@126.com; 黄厚今，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：营养毒理学，E-mail:1026553087@qq.com。

R917

A

1000-2715(2017)05-0560-04