福建省茶树品种资源初步关联分析

杨 军，孔祥瑞，王让剑，郑国华

(福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

福建省茶树品种资源初步关联分析

杨 军，孔祥瑞，王让剑，郑国华

(福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

为挖掘茶树农艺性状相关的分子标记位点，选用38对SSR引物对43份福建茶树品种进行多态性扫描与群体结构分析。在群体遗传结构分析的基础上采用Tassel GLM(general linear model)和 MLM(mixed linear model)方法进行标记与农艺性状的关联分析。共检测出238个等位变异，每个位点6.26个等位变异。供试群体的 Shannon 指数平均值为1.261。通过群体遗传结构分析将供试材料划分成3个亚群。以 GLM 分析，发现8个与种径、茶类、百粒重和花瓣数相关联的标记，对表型变异的解释率分别54.3%、13.3%～21.8%、57.2%和50.9%；以MLM分析，发现 6 个与种径、茶类和百粒重相关的标记，各标记对表型变异的解释率分别为54.2%、19.7%～24.2%、31.1%。

茶；SSR；群体遗传结构；关联分析

茶树是多年生常异花授粉植物，构建群体进行QTL定位难度较大，且时间较长。关联分析仅需以自然群体为材料，通过分子标记进行全基因组多态性扫描，结合目标性状调查，就可以发掘相关联的优异等位基因。因此，关联分析方法比较适合茶树上目标性状等位基因的挖掘与辅助育种。关联分析的材料一般选择代表性强，来源广泛，其中有选择芝麻、可可核心种质[1-2]、籼稻微核心种质[3]、全国范围内具代表性的豇豆种质[4]、国内外大麦品种[5]等进行关联分析。同时，近年关联分析在植物的抗性、农艺性状、产量、品质等性状上有较多研究，检测到烟草赤星病抗性[6]、水稻纹枯病[7]、青稞的穗粒数、株高等[8]、向日葵分枝性状[9]、玉米穗行数[10]、陆地棉叶枝数[11]、大麦的株高、穗长等[12]、半野生棉仁含油量[13]等显著关联的分子标记。目前使用SSR标记对茶树农艺性状进行关联分析研究的报道相对较少，本研究对43份福建审(认)定茶树品种材料进行关联分析，筛选描述茶树品种特征特性密切相关的性状，花、果、常规生化成分等性状相关的分子标记，为后期茶树等位基因发掘与分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于福建省农业科学院茶叶研究所，福建省审(认)定茶树品种43个，采集各个材料一芽二叶鲜叶保存在-70℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用改进的CTAB法[14]提取茶树基因组DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行茶树基因组分子量大小检测，用756-MC型紫外分光光度计测定茶树基因组DNA的纯度(OD260/280比值)。

1.2.2 农艺性状调查数据 农艺性状来源于《福建省茶树品种图志》[15]调查数据，详细见表1。

1.2.3 引物合成 参照文献[16-17]引物序列，序列由上海Sangon公司合成。

1.2.4 PCR扩增和产物鉴定 PCR反应体系为：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，热循环程序为：94℃预变性4 min，使模板DNA 充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性45 s，不同温度条件退火60 s，72℃延伸75 s，重复35个热循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物统一在反向引物(R)的5′段标记荧光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。扩增产物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混匀后使用ABI公司3730XL进行毛细管电泳。

1.2.5 数据处理 采用ABI公司的GeneMapper 4.0软件，选择GeneScanTM500 ROXTM作为分子量标准，对每一个扩增出的条带记录大小。运用PopGen3.2软件计算Shannon信息指数、观测杂合度、期望杂合度。应用PIC_CALC引物的PIC值。方差分析采用SAS。

1.2.6 关联分析 使用Struture 2.3.4[18]进行群体结构分析，先计算各材料归属第k亚群的概率Q值。使用混合模型K值从2设置到9模拟群体结构，每一个K值重复6次。将MCMC迭代设为100000次，初始burn-in次数为100000。依据似然值最大原则选取合适的K值为群体数目，计算Q参数，将其作为协变量，并CLUMPP对多次运行结果的进行整合。以SPAGeDi-1.3d处理基因型数据获得个体间亲缘关系Kinship矩阵[19]。

采用Tassel 3软件一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)两种程序进行关联分析。GLM分析中，以各亲本材料的对应Q值作为协变量，将SSR标记与花冠直径、百粒重、氨基酸、种径等表型性状进行回归分析，寻找与之相关联的标记，并确定其解释率；MLM分析中，采用Q+K方法分析，性状与GLM分析相同，确定关联位点，并计算标记对表型变异的解释率。

表1 茶树品种农艺性状数据

(续表1)

品种名称花冠直径(cm)花瓣数(片)果实直径(cm)果皮厚度(cm)一芽三叶重(g)种径(cm)百粒重(g)茶多酚(%)氨基酸(%)咖啡碱(%)水浸出物(%)茶类大叶乌龙4.662.200.06075.01.6276.2017.54.23.448.3乌龙茶福云20号4.472.150.06796.51.36135.8018.83.93.450.6绿茶春兰4.271.920.06758.01.41102.4015.63.93.751.4乌龙茶凤圆春3.372.080.096148.81.4963.4014.55.23.742.7乌龙茶铁观音3.261.680.07060.51.25123.9417.44.73.751.0乌龙茶黄观音3.962.140.08858.01.28112.2019.44.83.448.4乌龙茶杏仁茶3.262.030.050139.61.39139.5015.64.73.745.4乌龙茶紫玫瑰3.262.020.04062.01.31110.7016.34.53.148.4乌龙茶九龙袍4.161.660.07083.01.25126.5818.84.13.249.9乌龙茶福安大白茶3.87NANA98.0NANA15.56.13.451.3绿茶黄奇4.462.120.07165.01.2287.9019.64.24.050.2乌龙茶歌乐茶3.872.080.13180.01.6170.0013.55.73.646.2绿茶黄棪2.9562.100.07059.01.4895.8016.23.53.648.0乌龙茶紫牡丹4.062.020.04054.01.31110.7018.43.94.348.6乌龙茶丹桂4.261.940.06866.01.2390.0017.73.33.249.9乌龙茶大红袍3.462.350.070NA1.18101.1617.15.03.551.0乌龙茶福云6号3.562.180.08369.01.32108.5814.94.72.945.1绿茶梅占4.161.800.080103.01.35105.3016.54.13.951.7乌龙茶福鼎大毫茶4.7571.800.090104.01.5190.5017.35.33.247.2绿茶福鼎大白茶3.8581.630.06063.01.33118.5014.84.03.349.8绿茶金萱4.072.080.079NA1.4990.5019.24.43.349.9乌龙茶福建水仙4.0571.530.150112.01.47109.4417.63.34.050.5乌龙茶毛蟹4.462.110.10068.51.44119.8614.74.23.248.2乌龙茶金观音3.672.000.06050.01.51163.6219.04.43.845.6乌龙茶福云5953.472.320.060111.01.6995.4012.54.74.747.3绿茶绿芽佛手4.082.900.096147.01.78100.5016.23.13.149.0乌龙茶肉桂371.860.07053.01.1475.8817.73.83.152.3乌龙茶悦茗香4.161.900.07060.01.26125.8221.43.63.949.4乌龙茶政和大白茶4.87NANA123.0NANA13.55.93.346.8绿茶白芽奇兰4.071.810.118139.01.2852.0016.43.63.948.2乌龙茶榕春早3.571.850.063NA1.0690.0017.74.63.245.9绿茶春闺3.072.510.090NA1.3575.8013.34.23.841.4乌龙茶

注：NA代表数据缺失。

2 结果与分析

2.1 引物多态性与等位位点分析

从表1中看出，38对SSR标记在参试材料中共检测到等位位点238个，平均每对引物检测到6.26个，其中最多为SSR2、SSR16为13个，多态性十分丰富；38对引物的PIC值在0.255～0.841之间，平均为0.580，筛选出来的引物具有较强鉴定能力；SSR引物的Shannon指数变幅为0.506～2.158，平均值为1.261，参试茶树种质材料群体间的遗传变异较大，具有较为丰富的遗传多样性。计算观测杂合度与期望杂合度平均值比较接近，说明筛选的引物检测到的等位基因在参试材料中分布相对均匀。

2.2 群体遗传结构分析

利用Structure 2.3.1软件，基于数学模型分析由43份材料构成的参试材料的遗传结构，发现样本的等位变异频率特征类型数K呈持续增大趋势，当K=4时出现峰值，并呈现明显的拐点(图1)。由此将43份茶树亲本分为3个类群(图2)，分别包含9、11和23份。该自然群体结构比较简单，能够有效地降低群体结构对关联分析产生的影响。

表2 38对引物的扩增结果

图1 Structure分析中△K随K值的变化Fig.1 △K value from structure analysis

2.3 SSR标记与部分农艺性状的关联分析

GLM分析结果显示，在所检测的38个标记中有8个与种径、茶类、花瓣数、百粒重显著相关(P<0.01)。同时，将P值进行蒙特卡罗模拟显著性检测(防止伪关联)，SSR14、SSR15、SSR16、SSR19、SSR26、SSR37达到显著性标准(P<0.05)，其中5个与茶类相关，1个与种径相关。各标记对表型变异的解释率为13.3%～54.3%，解释率最大的标记是SSR37为54.3%,与种径相关(见表3)。

MLM分析结果显示，在所检测的38个标记中有6个与种径、茶类、百粒重数显著相关(P<0.05)，其中4个与茶类相关，1个与种径相关，1个与百粒重相关。各标记对表型变异的解释率为19.7%～54.3%。MLM分析检测到与农艺性状相关的SSR比GLM分析结果少2个，其中有5个标记与GLM 分析得到的相同，但解释率均有所上升，但P值标准变大，准确性不如GLM。

3 讨论与结论

3.1 GLM与MLM分析结果相比较

本试验GLM模型关联显著性选择的P<0.01，而MLM模型关联显著性选择的P<0.05，与前人研究相一致[20-21]。从P值选择标准来看，是GLM模型分析结果相对更准确，但李晓娜等[13]认为，GLM模型以各亲本材料的对应Q值作为协变量，MLM模型采用Q+K方法分析，不仅考虑群体结构Q的影响，还考虑两两材料间的亲缘关系(Kinship)系数，减少“伪关联”的数目，分析获得的结果更加准确可靠。5对标记在MLM模型与GLM模型中都检测达到显著差异，因此，这5对标记的关联分析结果可靠性相对较高。单一模型中达到显著差异花瓣数、百粒重性状，需要进一步检测。

图2 K=3时，Structure的运算结果Fig. 2 Calculated results of structure(K=3)

表3 与农艺性状显著(P<0.05)相关的位点及其对表型变异的解释率

3.2 关联分析结果

本试验选择的目标性状主要参考茶树品种志中对茶树品种特征特性的描述，其中，氨基酸、咖啡碱等生化成分未检测到显著相关的分子标记，推测是参试材料较少、引物数量不足与常规生化成分受年份、取样等因素影响较大。茶树品质相关基因的挖掘一直是茶树辅助育种与资源鉴定的重点，尤其是乌龙茶香气、滋味相关品质基因。乌龙茶香气、滋味品质是在加工过程中形成，目前还没有明确受主要影响因子控制，推测是多基因共同起作用的。乌龙茶与绿茶间最大的品质特征差异是香气、滋味品质，茶类性状有可能与乌龙茶滋味、香气品质相关，参考前人研究对福建省茶树品种进行乌龙茶与绿茶分类，利用分子标记进行扫描与关联分析。从中筛选到5对与茶类显著相关的标记，连锁群参考Ma Jian-qiang[16]等的研究结果，5对标记位于不同的连锁群，初步说明茶类性状是多位点，多基因共同控制，与实验预期一致。以这些标记作为组合，可以初步鉴定福建野生资源、地方资源的遗传组成偏向绿茶或乌龙茶，进行杂交亲本辅助选择。同时，进行绿茶与乌龙茶杂交时，在幼龄期具有绿茶表型性状群体中，选择具有乌龙茶遗传组成的后代，可以初步辅助选择高香绿茶新品系。

致谢：感谢试验过程中陈常颂研究员等人的支持。

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APreliminaryReportonAssociationAnalysisofTeaVarietiesinFujian

YANG Jun, WANG Rang-jian, KONG Xiang-rui, ZHENG Guo-hua

(TeaResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences/FujianBranch,NationalCenterforTeaImprovement,Fu’an,Fujian355015,China)

To identify the molecular marker loci related to specific tea agronomic traits, 38 simple sequence repeat (SSR) markers were selected for the polymorphism detection and population structure analysis on 43 tea varieties found in Fujian. The population structure was analyzed based on the polymorphic SSR markers, while the association between the markers and agronomic traits was determined by fitting the data to TASSEL general linear model (GLM) and mixed linear model (MLM). A total of 238 alleles were detected in the 43 tea varieties with an average count of 6.26. The averaged Shannon’s index was 1.261. The structure analysis showed 3 genetic subpopulations for the varieties tested. The association of markers and traits based on GLM showed 8 SSR markers relating to the seed stem, tea type, hundred-grain weight and flower petal count of a plant, with the phenotypic contributions of 54.3%, 13.3%～21.8%, 57.2%, and 50.9%, respectively. Whereas, MLM indicated that 6 SSR markers closely related to the seed stem, tea type, and hundred-grain weight, with the phenotypic contributions of 54.2%, 19.7%～24.2% and 31.1%, respectively.

tea plant; SSR; population structure; association analysis

S571.1

A

2096-0220(2017)03-0115-06

2017-06-27初稿；2017-08-11修改稿

福建省现代农业(茶叶)产业技术体系建设项目(2014～2017)；福建省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1012-7、2017R1012-6)；福建省自然科学基金项目(2015J01098)；福建省农业科学院茶树种质资源创新团队项目(STIT 2017-3-12)。

杨军(1981-)，男，助理研究员，从事茶树种质资源与遗传育种研究。E-mail:yangjun007@qq.com