虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物的 流变特性

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(1.大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034； 2.海南出入境检验检疫局,海南海口 570311)

虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物的 流变特性

阎佳楠1,李毅2,唐越1,张萌1,商文慧1,杜椅楠1,姜卉1,吴海涛1,*

(1.大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034； 2.海南出入境检验检疫局,海南海口 570311)

本文对虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物的流变特性进行了研究,为虾夷扇贝的综合利用奠定研究基础。以虾夷扇贝雄性生殖腺为原料,选用木瓜蛋白酶作为工具酶,通过SDS-PAGE分析酶解过程中蛋白质分子量的变化,利用流变仪考察酶解液的流变特性;利用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)在前期对样品进行孵育,探讨DNA分子对于其流变特性的作用影响。结果显示,虾夷扇贝雄性生殖腺经木瓜蛋白酶(30000 U/g蛋白)酶解15～180 min后,蛋白质发生显著降解。在不同流变仪扫描模式下,酶解液的储存模量G′、损耗模量G″、黏度η、复数黏度η*均明显高于未酶解样品。酶解3 h时,应变扫描中,应变为1%时,G′、G″分别达到了188.9 Pa和17.9 Pa;频率扫描中,频率为0.1 Hz时,η*达到230.9 Pa·s。经DNaseⅠ处理后,酶解液流变参数(G′、G″及η*)显著降低,但略高于未酶解样品。上述结果说明,虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物以弹性占主导,具有明显的剪切稀化现象,且其流变特性可能与肽分子和DNA分子有关。

虾夷扇贝,雄性生殖腺酶解物,凝胶,流变特性

食品胶体是一类润滑、黏稠或胶冻状的物质,因其具有稳定、乳化、悬浮食品颗粒的作用,并可赋予食品适宜的口感,在食品工业中得到广泛应用[1]。食品胶体通过氢键、范德华力或离子键桥的作用,形成空间网状结构,进而形成凝胶状物质[2]。近年来,随着国民健康意识的增强,在保证食品功能特性的前提下,对食品营养价值的要求越来越高。因此,开发新型营养型食品胶体具有切实意义。

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)是重要的海产贝类,富含蛋白质等营养成分。2015年,全国扇贝总产量达到178.5万吨[3]。在肥满期,虾夷扇贝生殖腺是扇贝的重要可食部位,极具开发价值。本文前期研究发现,经中性蛋白酶酶解后的虾夷扇贝雄性生殖腺呈凝胶状态,当达到适当浓度时,其硬度、凝聚性等指标可与食用胶相当,具有广阔的应用前景[4-6]。

研究显示,针对某些蛋白质原料,蛋白酶酶解可促进微粒间聚集作用,增加疏水结构,而形成空间三维网状构象,使产品体现出一定的凝胶特性。例如大豆蛋白[7-8]、乳清蛋白[9-10]等在适当酶解条件下,均显示出良好的凝胶状态。另外,也有研究显示,经胰蛋白酶水解后的卵黄颗粒,其流变性能也随凝胶的形成显著增强[11]。流变学主要用于研究物质的流动与形变的特性[12-14]。在食品工业中,流变特性可反映食品受到外力干扰后,其结构和性质的变化,近年来被广泛应用于食品胶体及食品原料的特性研究中[15-17]。因此,借助流变特性这一相关有效研究手段,可对虾夷扇贝生殖腺酶解物凝胶特性进行深入探究。

综上所述,本文将研究对象锁定为虾夷扇贝雄性生殖腺,使用木瓜蛋白酶进行酶解,获得凝胶状酶解物,通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)了解其分子量随时间变化情况;利用流变仪研究虾夷扇贝生殖腺酶解物的流变特性。此外,鉴于雄性生殖腺中含有一定的脱氧核糖核酸,利用DNA酶(DNaseⅠ)研究DNA分子对酶解物流变特性的影响,为深入探究虾夷扇贝生殖腺酶解物凝胶形成机制奠定研究基础,以期挖掘虾夷扇贝酶解物凝胶在食品胶体工业中的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

肥满期的虾夷扇贝(3月初购买,贮存于-80 ℃冰箱) 大连长兴水产品批发市场；木瓜蛋白酶(酶活为30000 U/g) 生工生物工程(上海)有限公司;DNA降解酶(DNaseⅠ酶,酶活为70 U/μL) 宝生物工程(大连)有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;Sartorius PB-10型pH计 塞多利斯科学仪器(北京)有限公司;AE-6450型垂直电泳仪 日本ATTO株式会社;MF-ChemiBIS 2.0型凝胶成像仪、DNR Bio-imaging;Discovery HR-1型旋转流变仪 美国TA仪器；2KBTES-55型真空冷冻干燥机 美国Virtis公司;CF16RXⅡ型冷冻离心机 日本日立公司;BCD-203C型电冰箱 杭州华日电冰箱股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 原料处理 选取鲜活虾夷扇贝,分离雄性生殖腺,乳白色,用去离子水将其洗净后,煮沸10 min使内源酶失活,待冷却至室温,将其进行冻干,收集冻干粉贮藏于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的制备 以虾夷扇贝雄性生殖腺冻干粉为原料,用去离子水配制成底物蛋白含量为4%(m/w)的悬浊液,采用0.1 mol/L NaOH溶液调整溶液pH至7.0,加入木瓜蛋白酶,加酶量为3000 U/g蛋白质、50 ℃、pH7.0的外界条件下酶解15～180 min,之后在100 ℃条件下灭酶10 min,之后将酶解液冷却备用。

在考察DNaseⅠ对虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性影响时,在加入木瓜蛋白酶前,采用DNaseⅠ在室温下处理原料,加酶量为500 U/mL,180 min后,经100 ℃灭酶10 min,冷却后,按照1.3.2方法利用木瓜蛋白酶进行酶解(3 h)。

1.3.3 水解度的测定 根据李毅[6],采用pH-stat法加以适当修改,进行虾夷扇贝生殖腺酶解物水解度的测定,计算公式如下:

式中:DH-水解度,%;B-保持溶液pH不变时所消耗的NaOH的体积,mL;Nb-碱的当量浓度,0.5 mmol/L;Mp-底物中蛋白质总量,g;htot-底物蛋白中肽键总数,mmol/g,本研究中htot以7.5计;α-水解过程中α-氨基的解离度,计算公式如下:

式中:pH-水解度测定过程中,酶解液体系恒定酸碱度;pK-本研究中pK以7.5计。

1.3.4 SDS-PAGE检测 以不同酶解时间(15～180 min)的样品为待测样,以250 mmol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液+8 mol/L尿素+5% SDS+5%巯基乙醇为上样缓冲液,将二者以1∶1 (v/v)的比例混合,振荡摇匀,利用沸水浴加热5 min,在振荡条件下过夜静置,次日,在4 ℃下,以12000×g转速离心10 min,取离心后上清液进行SDS-PAGE垂直电泳检测。实验中,浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%、15%,电流分别为8、15 mA,以SDS-Tris-甘氨酸体系作为电泳缓冲液。电泳完毕后,利用考马斯亮蓝R-250对实验样品进行染色,之后利用50%乙醇+9%冰乙酸脱色液进行脱色,利用凝胶成像仪对所得电泳胶片进行成像分析。

1.3.5 流变特性的测定 以利用木瓜蛋白酶(3000 U/g蛋白)酶解30、180 min以及经DNase I孵育后的虾夷扇贝生殖腺酶解液为研究对象,将各酶解液100 ℃灭活后,在4 ℃内静置过夜,采用流变仪进行酶解液的流变特性测定。

流变测定的基本测定参数为:夹具采用40 mm的平行板,Gap值为1 mm,温度控制为15 ℃,扫描模式包括应变扫描(Oscillation Amplitude)、频率扫描(Oscillation Frequency)和剪切速率扫描(Flow Sweep)。应变扫描范围为0.1%～1000%,固定频率为1 Hz;频率扫描范围为0.1～10 Hz,固定应变为2%;剪切速率扫描范围为0.1～100 s-1。

1.4数据处理

采用SPSS 13.0软件进行显著性分析,p<0.05时具有显著性差异;采用Microsoft Excel工作表软件进行作图。

2 结果与讨论

2.1虾夷扇贝雄性生殖腺酶解过程中蛋白质酶解情况

利用木瓜蛋白酶对虾夷扇贝雄性生殖腺进行酶解,当酶解15、30、60、120、180 min时,其水解度可分别可达到8.58%、10.24%、12.32%、12.99%以及13.64%(数据未显示),说明虾夷扇贝雄性生殖腺在不断被木瓜蛋白酶降解,120 min时,其降解速率减缓,之后趋于稳定。采用SDS-PAGE分析虾夷扇贝雄性生殖腺在酶解过程中蛋白质的降解情况,如图1所示,虾夷扇贝雄性生殖腺中含有多种不同分子量的蛋白质,在14.3～200 kDa 之间均有不同程度的分布,其主要组分集中14.3～20.1 kDa以及44.3 kDa 左右。随酶解时间延长,不同分子量的蛋白质均显示出不同程度的降解,在酶解时间为15 min时,电泳条带与未酶解样品条带相比,显著变浅,且20.1kDa以上组分酶解较明显。当达到180 min时,虾夷扇贝雄性生殖腺中蛋白质组分全部降解,产物主要集中在14.3 kDa以下。上述结果说明随着酶解时间的延长,虾夷扇贝生殖腺中大分子蛋白质逐渐降解,由大分子蛋白质转变为小分子的肽组分。

图1 虾夷扇贝雄性生殖腺酶解过程中蛋白质的酶解情况Fig.1 SDS-PAGE pattern of SMGHs注:HM代表高分子量Marker,LM代表低分子量Marker。

2.2虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性的应变扫描

应变扫描是在恒定的频率和温度下,给材料施加一定范围的交变应变,测量聚合物黏弹响应随应变变化的关系,其中G′为弹性模量,代表流体弹性行为;G″为黏性模量,代表流体黏性行为,二者相平行的区间为流体线性黏弹性区(LVR),其余区间为非线性黏弹性区(n-LVR),区间中间点所对应的应变值可作为频率扫描的固定参数[18-19]。如图2所示,虾夷扇贝雄性生殖腺未酶解的悬浊液(0 min),随着应变值增加,G′和G″均保持不变,响应值很小,反应出此时的样品凝胶性极差或者不存在凝胶特性。当酶解时间达到30 min和180 min时,随着应变量的增加,G′和G″起初均保持不变且相互平行,当应变达到2%后,G′开始急剧减小,与此同时,G″急剧增加之后呈下降趋势,直到应变达到60%左右,G′均大于G″,表明此阶段的酶解物表现为半固态行为,流动性相对较弱,呈现出一定的凝胶特性,当应变进一步提高,G′和G″二者出现交点,黏性特性开始高于弹性特性,G″占主导,此时的凝胶被逐渐破坏,流动性逐渐增强,酶解物显示出流体性质。此外,随着酶解时间增加G′、G″也相应增加,在180 min,应变为1%时,G′、G″分别达到了188.9 Pa和17.9 Pa,说明酶解物的弹性和黏性随酶解程度的增加而增强。

图2 虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的应变扫描Fig.2 Oscillation strain scanning of SMGHs

在未进行酶解时(0 min),虾夷扇贝雄性生殖腺冻干粉溶液呈悬浊液状态,无凝胶性。在木瓜蛋白酶(3000 U/g 蛋白)酶解后,经灭酶处理,冷却放置过夜后,样品呈现凝胶状,具有流变性。因此,以30 min和180 min酶解所得样品为代表,进一步利用流变仪考察虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的流变特性。

2.3虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性的频率扫描

频率扫描是在固定应变下,对材料施加正弦频率的交变运动,测试材料黏弹性与频率变化的关系[18]。如图3A所示,在频率为0.1～10 Hz的范围内,虾夷扇贝雄性生殖腺酶解液均体现出典型的黏弹性固体流变曲线,即G′始终大于G″,进一步表明,虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的弹性占主导。另外,随着酶解时间延长,G′和G″相应增加,说明酶解促进了虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的黏弹特性。

复数黏度η*体现了黏度和弹性共同的贡献,可作为表征聚合物流体的黏弹性质的一个重要指标。如图3B所示,一方面,随着酶解时间增加,复数黏度η*值增加,这与图2和图3A的结果趋势相一致,在180 min,频率为0.1 Hz时,η*可达到230.9 Pa·s;另一方面,复数黏度η*随频率增加急剧下降,说明虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物在不断增加的频率剪切下,呈现出明显的剪切变稀现象,体现出弱凝胶性质。

表1 DNaseⅠ对虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性的影响相对值Table 1 Relative values for the effect of DNaseⅠon hydrolysates from SMGs

图3 虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的频率扫描Fig.3 Frequency scanning of SMGHs

注：酶解物DnaseⅠ(-)代表未经DNase I处理的样品,酶解物DnaseⅠ(+)表示经过DNase I处理的样品。

2.4虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性的剪切速率扫描

剪切速率扫描即在规定的剪切速率范围内,对流体进行剪切扫描,可获得黏度、剪切应力等指标的变化规律,之后以剪切应力作为剪切速率的函数作图,将得到的曲线进行一定方程拟合可得出屈服应力,此方法可以真实反映样品性质,从而得到最广泛应用[20]。如图4所示,在规定的剪切速率范围内(0.1～5 s-1),随着剪切速率的增加,虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的黏度急剧减少;直到5 s-1时,酶解物黏度的减小趋势变缓,趋于稳定,呈现出明显的剪切稀化现象。另外,在剪切速率扫描模式下,酶解30、180 min的虾夷扇贝酶解物样品的黏度相差不大,考虑原因可能为样品的特殊性,呈现弱凝胶特性,故在剪切速率扫描时,30 min和180 min的样品的黏度变化相差不大。但二者的黏度均明显高于未酶解样品。

图4 虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物剪切速率扫描Fig.4 Shear rate scanning of SMGHs

2.5DNA对虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物流变特性的影响

DNA降解酶(DNase I)作为一种典型的DNA降解酶,可有效降解样品中DNA组分。为了进一步探索在虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物凝胶形成时,DNA分子的作用贡献,通过前期利用DNase I酶对原料进行孵育,之后测定孵育前后酶解物在不同应变、频率和剪切速率下流变特性的变化,结果见表1所示。与未添加DNase I的酶解物相比,经DNase I处理后的酶解液的流变特性发生显著变化。在应变和频率扫描中,DNase I可明显降低虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的G′、G″以及η*,但略高于未酶解样品。在剪切速率扫描中,DNase I可明显降低虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物的η,且略低于未酶解样品。以上结果表明,经过DnaseⅠ处理后,虾夷扇贝雄性生殖腺凝胶状酶解物的凝胶特性被不同程度的破坏,呈现出液体状态。近年来,有关于DNA分子与肽分子的相互作用得到广泛研究[21-26]。Bitton等[21]研究发现,GCN4(KDPAALKRAR NTEAARRSRA RKLQRMKQLE)多肽与DNA分子间通过静电引力相互作用。Gour等[22]利用寡核苷酸与二苯基二肽形成共轭体系,制备DNA-肽自组装体,经实验发现,新体系呈囊泡状,可作为一种潜在的包埋材料。Kye等[23]建立了超分子结构的肽-DNA共轭体系,螺旋状结构的DNA与β-折叠状结构的肽通过静电引力相互结合,具有稳定的结构。在本次研究中,由于加入了DNA降解酶DNase I的缘故,使样品内部DNA分子遭到一定程度的破坏,进而导致DNA分子无法与样品中肽组分进行结合,使样品的凝胶特性被破坏。综上所述,在虾夷扇贝雄性生殖腺酶解成胶过程中,DNA分子可能起到了关键性作用,而关于其具体作用机制以及成胶机理,还需进一步探究。

3 结论

经过木瓜蛋白酶处理后的虾夷扇贝雄性生殖腺酶解物可体现出较好的流变特性,其储存模量G′、损耗模量G″、黏度η和复数黏度η*较未酶解样品相比均显著提高。虾夷扇贝雄性生殖腺凝胶状酶解物的流变特性以弹性占主导,具有明显的剪切稀化现象。虾夷扇贝雄性生殖腺凝胶状酶解物的形成可能与酶解后的小分子肽以及DNA分子有关。

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Rheologicalpropertiesofproteinhydrolysateswithgelpropertiesfromscallop(Patinopectenyessoensis)malegonads

YANJia-nan1,LIYi2,TANGYue1,ZHANGMeng1,SHANGWen-hui1,DUYi-nan1,JIANGHui1,WUHai-tao1,*

(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,National Engineering Research Center of Seafood,Dalian 116034,China; 2.Inspection and Quarantine Technology Center,Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

In order to provide a foundation for comprehensive utilization of scallop(Patinopectenyessoensis),the rheological properties of hydrolysates from scallop(Patinopectenyessoensis)gonad(SMGHs)were studied. The hydrolysates were obtained from scallop male gonads(SMGs)by using papain as a tool enzyme. The changes in molecular mass of proteins were investigated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). The rheological properties of SMGHs were determined by rheometer. The effect of DNA on rheological properties of SMGHs was also investigated by incubated with DNase Ⅰ. The results showed that the proteins of SMGs were significantly degraded after hydrolysis with papain at a dosage of 30000 U/g protein for 15～180 min. Under various sweep models,the values of storage modulusG′,loss modulusG″,viscosityη,complex viscosityη*of SMGHs were obvious higher than those of SMGs. After hydrolysis for 3 h,the initial values ofG′,G″ during oscillation strain scanning were up to 188.9,17.9 Pa at oscillation strain of 1%,respectively. The value ofη*was 230.9 Pa·s at frequency of 0.1 Hz. The rheological properties(G′,G″η*)of SMGHs decreased significantly,but slightly higher than those of SMGs,by treatment with DNaseⅠ. These results suggest that the elastic property is dominant in SMGHs exhibiting obvious shear thinning effect. Moreover,the rheological properties of SMGHs might be related to peptides and DNA molecule.

scallop(Patinopectenyessoensis);male gonads hydrolysates;gel;rheological properties

2017-05-02

阎佳楠(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail:1070378773@qq.com。

*

吴海涛(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：wht205@163.com

国家自然科学基金项目(31671808)。

TS254

A

1002-0306(2017)21-0047-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.010