基于线粒体Cytb基因和D-loop区序列的高邮湖湖鲚(Coilia nasus)遗传多样性分析

李大命，张彤晴，关浩勇，唐晟凯，刘燕山，刘小维，潘建林

(江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室，南京 210017)

基于线粒体Cytb基因和D-loop区序列的高邮湖湖鲚(Coilianasus)遗传多样性分析

李大命，张彤晴，关浩勇，唐晟凯，刘燕山，刘小维，潘建林

(江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室，南京 210017)

本研究利用线粒体细胞色素b(Cytb)基因和控制区(D-loop)序列作为分子标记，调查了高邮湖湖鲚(Coilianasus)种群遗传多样性。结果显示，Cytb基因和D-loop区序列碱基A+T含量均高于G+C含量，显示碱基组成具有偏倚性。38条Cytb基因序列检出26个变异位点，定义13个单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.716±0.078和0.002 70±0.000 57；40条D-loop区序列检出53个变异位点，定义21个单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.906±0.034和0.006 27±0.000 99。13个Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001～0.014之间，NJ系统进化树显示单倍型聚为1支；21个D-loop区单倍型之间的遗传距离在0.001～0.019之间，NJ系统进化树显示单倍型聚为2支。中性检测结果和歧点分布图均表明高邮湖湖鲚种群稳定，近期没有发生种群扩张。整体来看，高邮湖湖鲚种质资源遗传多样性水平较高，具有高单倍型多样性和低核苷酸多样性的特征。

湖鲚(Coilianasus)；遗传多样性；线粒体DNA；细胞色素b基因；控制区序列

刀鲚(Coilianasus)是一种具有重要经济价值的洄游性中小型鱼类，隶属于鲱形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鲚属(Coilia)。近年来，由于过度捕捞、环境污染及水利工程建设等因素，刀鲚天然资源趋于枯竭，保护刀鲚资源刻不容缓[1-4]。湖鲚是刀鲚一种湖泊定居型，它没有徊游习性，在我国淡水湖泊中广泛分布，且占渔业资源量的比重较高，已成为渔业资源的重要组成部分[5-7]。研究显示湖鲚和刀鲚在遗传上没有显著差异，属于同一种类[8-9]。

遗传多样性是生物多样性的一个重要方面，决定了物种的进化潜能和对环境变化的适应能力。掌握物种的遗传多样性水平是物种保护需要了解的重要内容，可以为制定针对性的保护和管理策略提供科学依据。鱼类线粒体DNA是一种闭合、环状的双链DNA分子，具有结构简单、母系遗传、不发生重组及进化速度快等特征，使其成为分子群体遗传学和分子系统学研究的重要分子标记[10]。细胞色素b(Cytochrome b，Cytb) 基因的结构和功能在mtDNA的13个蛋白质编码基因中被了解得最为清楚，且其进化速度适中[11-12]。线粒体DNA控制区(D-loop)为非编码区，因缺乏编码的选择压力而比其他线粒体基因的进化速率更快，富含系统发育信息[13]。因此，Cytb基因和D-loop区序已成为鱼类种群遗传结构与遗传多样性研究中常用的2个分子标记。

高邮湖是江苏省第三大淡水湖、全国第六大淡水湖，水域面积780 km2。高邮湖具有渔业生产、工农业及生活用水、航运、旅游、泄洪行洪等多种功能[14]。高邮湖有鱼类63种，湖鲚是高邮湖渔业资源的优势种类之一。受生态环境污染、不合理渔业生产方式及涉湖、涉渔工程建设的影响，高邮湖渔业资源量显著下降，渔业可持续发展受到严重威胁[15]。到目前为止，有关高邮湖鱼类的遗传学资料较少。仅有研究者调查了高邮湖日本沼虾的遗传多样性[16]。已有研究者开展了我国10个湖鲚地理群体遗传多样性和遗传结构的研究，其中包括太湖、洞庭湖、鄱阳湖及巢湖群体[17]。但到目前为止，尚无有关高邮湖湖鲚遗传多样性的研究报道。本研究采用Cytb基因和D-loop区序列作为分子标记，对高邮湖湖鲚遗传多样性开展研究，不仅有利于丰富高邮湖鱼类的分子生物学数据，而且可以为湖鲚种质资源保护及合理利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样本收集和处理

湖鲚于2016年12月份在高邮湖用刺网捕获，随机取40尾湖鲚样本，体长在10.5～24.5 cm之间，平均体长为16.2 cm；体重在3.5～31.7 g之间，平均体重为16.3 g。用无水乙醇固定，带回实验室置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

取湖鲚肌肉组织用于基因组DNA提取。采用Takara公司的DNA提取试剂盒提取总DNA，将DNA溶于灭菌超纯水，保存于-20 ℃冰箱备用。

扩增Cytb基因序列的上游引物为L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物为(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[18]；扩增D-loop区序列的上游引物为DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物为DR2为(5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG 3′)[2]。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR体系均为50 μL，包括2×Taq酶混合液(Taq酶1.25 U，DNTP 0.2 mmol/L，Mg2+L 1.5 mmol/L) 上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，灭菌超纯水22 μL。PCR反应条件下如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，53 ℃退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行双向测序，测序引物与扩增引物相同。

1.3 数据分析

采用ClustalX1.83软件[19]对获得的Cytb基因和D-loop区序列进行多重比较，并人工校对。采用Mega 5.1软件[20]分析序列碱基组成和变异位点，利用Kimura双参数(Kimura-2-parameter)模型计算单倍型之间的遗传距离，采用邻接法(Neighbour-joining method，NJ)构建系统进化树。利用DnaSP 5.0软件[21]获得群体序列遗传多样性参数，包括单倍型数、单倍型多样性(h) 、核苷酸多样性(π) 和平均核苷酸差异数(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性检验，同时结合核苷酸不配对分布分析检验湖鲚种群历史动态。

2 结果

2.1 Cytb基因和D-loop区序列碱基组成

通过序列分析，本研究获得38条Cytb基因全序列，长度为1 141 bp，共检出26个变异位点，其中11个简约信息位点，15个单一信息位点，没有插入和缺失位点。4种碱基的平均含量分别为：A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)和C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2和3位点，碱基G的含量最低，表现出明显的碱基组成偏向性。

表1 Cytb基因序列碱基组成Tab.1 Base composition of Cytb gene sequence

通过序列分析，本研究获得40条D-loop区序列，其长度为1 214～1 290 bp，其中25条长度为1 252 bp，占比62.5%；11条长度为1 290 bp，占比27.5%；2条长度为1 328 bp，占比5%；2条长度为1 214 bp，占比5%。经比对，发现D-loop区序列有4处长度为38 bp的插入或缺失序列。4种碱基的平均含量分别为：A(33.3 %)、T(33.4%)、G (14.2%)和C(19.1%)，A+T的含量(66.7%)明显高于G+C的含量(33.3%)，表现出明显的碱基组成偏向性。D-loop区序列共检出53个变异位点，其中30个简约信息位点，23个单一信息位点。

2.2 种群遗传多样性参数

38条Cytb基因序列共定义13个单倍型(Hb1-Hb13)(GenBank序列号：MF589305～ MF589317)，单倍型Hb11的数量最多(20个)，占比52.6%，单倍型H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13的数量均为1个，占比2.6%，单倍型多样性为0.716，核苷酸多样性为0.00216，平均核苷酸差异数为2.463(表2)。40条D-loop区序列共定义21个单倍型(Hd1-Hd21)(GenBank序列号：MF589318～ MF589338)，单倍型Hd11数量最多(11个)，占比27.5%，单倍型Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21的数量均为1个，占比2.5%，单倍型多样性为0.906，核苷酸多样性为0.006 27，平均核苷酸差异数为7.568(表2)。整体来看，高邮湖湖鲚种群遗传多样性呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性特征。

表2 高邮湖湖鲚种群的遗传多样性参数Tab.2 Genetic diversity of C.nasus population in Gaoyou Lake

2.3 单倍型系统树

基于Kimura 双参数模型估算湖鲚单倍型之间的遗传距离，结果显示，Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001至0.014之间，D-loop区序列单倍型之间的遗传距离在0.001至0.019之间。

以凤鲚(C.mystus，GenBank登录号为KF056322.1)为外群，采用NJ法构建单倍型系统进化树，结果显示，Cytb基因单倍型聚为1支(图1)；D-loop区序列单倍型聚为2支，其中单倍型Hd7～Hd17聚为1支，单倍型Hd1～Hd6、Hd18～Hd21聚为1支(图2)。

2.4 种群历史动态

基于Cytb基因和D-loop区序列的中性检验结果(表3)表明，Cytb基因的Tajima′sD和Fu′sFs中性检验产生的D和Fs均为负值，其中D值统计结果显著(P=0.026)，Fs值统计结果不显著(P=0.088)。D-loop区的Tajima′sD和Fu′sFs中性检验产生的D为负值，Fs为正值，且统计结果均不显著。另外，Cytb基因和D-loop区序列核苷酸不配对分布呈多峰类型(图3和图4)。综合来看，高邮湖湖鲚种群较为稳定，近期内没有发生扩张事件。

3 讨论

遗传多样性即基因多样性，是指种内不同群体间或一个群体内不同个体的遗传变异的总和。

图1 湖鲚Cytb基因单倍型NJ系统进化树Fig.1 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake节点处的数字为1 000次bootstrap检验的支持率，图2同。

图2 湖鲚D-loop区序列单倍型NJ系统进化树Fig.2 Neighbor-joining molecular dendrogram based on the sequences of D-loop sequence of C.nasus in Gaoyou Lake

表3 湖鲚种群的中性检测结果Tab.3 Neutral test of C.nasus population based on Cytb gene and D-loop sequences

图3 高邮湖湖鲚Cytb基因序列核苷酸歧点分布图Fig.3 Distribution of pairwise differences for Cytb gene of C.nasus in Gaoyou Lake

图4 高邮湖湖鲚D-loop区序列核苷酸歧点分布图Fig.4 Distribution of pairwise differences for D-loop region of C.nasus in Gaoyou Lake

它不仅是生物多样性的重要组成部分，而且是物种多样性和生态系统多样性的基础，也是生命进化和物种进化的基础。一个物种的遗传多样性与其适应能力、生存能力和进化潜力等密切相关[22-23]。物种的遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力越强，反之，更容易受到环境变化的影响。单倍型多样性和核苷酸多样性是衡量物种遗传多样性的2个常用参数。本研究采用线粒体Cytb基因和D-loop区序列作为分子标记分析了高邮湖湖鲚的遗传多样性。结果显示，基于Cytb基因的湖鲚单倍型遗传多样性和核苷酸多样性分别为0.716和0.002 70，基于D-loop区的湖鲚单倍型遗传多样性和核苷酸多样性分别为0.906和0.006 27，显示出较高的遗传多样性。与基于Cytb基因序列相比，基于D-loop区序列湖鲚种群的遗传多样性相对较高，这是因为鱼类线粒体D-loop区序列受的选择压力较小、进化速率快，而Cytb基因作为线粒体编码基因，其进化速度相对较慢[10]。已有文献报道了基于Cytb基因的洞庭湖(h:0.643 3，π:0.002 6)、鄱阳湖(h:0.950 0，π:0.003 4)、太湖(h:0.857 0，π:0.002 1)和巢湖(h:0.901 5，π:0.002)湖鲚的遗传多样性水平[17]。可以得出，高邮湖湖鲚种群的遗传多样性水平高于洞庭湖湖鲚种群，而低于鄱阳湖、太湖和巢湖湖鲚种群。因此，高邮湖湖鲚种群的遗传多样性可以进一步提高。与湖鲚相比较，基于Cytb基因的刀鲚遗传多样性高于湖鲚[11]。同样，基于D-loop区序列的湖鲚遗传多样性也低于刀鲚[2-4]。这是因为湖鲚是刀鲚的陆封型群体[9]，由奠基者效应(Founder effect)等因素的影响，其遗传多样性水平应低于刀鲚[11]。

整体来看，基于Cytb基因和D-loop区序列高邮湖湖鲚遗传多样性呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性的特征。有研究者根据单倍型多样性和核苷酸多样性标准，将鱼类进化情景分为4种类型(低h(<0.5)和低π(<0.005)；高h和低π；低h和高π；低h和低π)[24]。可以看出，高邮湖湖鲚遗传多样性属于第2种类型。已有文献报道了湖鲚多个地理种群的遗传多样性水平，均具备这一特征[17]。湖鲚种群的遗传多样性现状可能是由一个较小的有效种群经历瓶颈效应或建群效应(bottlenecks or founder events)后迅速增长，尽管变异导致单倍型的多态性的积累，但核苷酸序列的多样化还未能积累造成[24-25]。另外，湖鲚是刀鲚的湖泊定居生态类型，种群进化时间较短，尚未有效积累更多的遗传变异。从种群历史动态来看，高邮湖湖鲚种群相对稳定，近期没有发生种群扩张。

基于Kimura双参数模型Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001至0.014之间，D-loop区单倍型之间的遗传距离在0.001至0.019之间。整体来看，单倍型之间的遗传距离较小，说明高邮湖湖鲚个体之间的基因交流不受限制。这是因为湖鲚运动能力较强，个体间基因交流不存在地理隔离限制。从单倍型组成来看，13个Cytb基因单倍型中优势单倍型Hb11有20个，占比52.6%；而9个单倍型(H2、H4～H7、H9～H10和H12～H13)的数量只有1个，均占比2.6%。21个D-loop区单倍型中优势单倍型Hd11有11个，占比27.5%；而17个单倍型(Hd1～Hd5、Hd9～Hd10和Hd12～Hd21)的数量只有1个，均占比2.5%。由此可以看出，湖鲚单倍型组成具有不均匀性。一方面优势单倍型的个体适应能力强拥有更大的繁殖群体，而低频率的单倍型则因环境适应能力差则拥有的繁殖群体较小，更容易对整个种群的遗传多样性造成不利影响。因此，需要持续加强对湖鲚种质资源保护力度，通过控制捕捞强度、改善水体生态环境以及加强资源动态变化监测等措施增加湖鲚资源量，提高其遗传多样性水平，改善种群遗传结构，从而有利于湖鲚资源的可持续发展。

致谢：感谢江苏省高宝-邵伯湖渔业管理委员会的许飞、王华和袁辉等对采样工作的帮助与支持。

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ThegeneticdiveristyofCoilianasuspopulationinGaoyouLakerevealedbymtDNACytbgeneandD-loopsequences

LI Da-ming，ZHANG Tong-qing，GUAN Hao-yong，TANG Sheng-kai，LIU Yan-shan，LIU Xiao-wei，PAN Jian-lin

(FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince；KeyLaboratoryofFisheriesResourcesinInlandWaterofJiangsuProvince，Nanjing210017，China)

Coilianasusis an important commercial fisheries species.In recent decades，the natural resource ofC.nasushas dramatically declined due to multiple factors.In the present study，the genetic diveristy ofC.nasuspopulation in Lake Gaoyou was investigated based on mitochondrial DNA cytochrome b (Cytb) gene and control region (D-loop) sequences.The content of A+T base pairs was higher than that of the C+G base pairs in bothCytbgene andD-loopsequences，which indicating that the base composition is biased.26 variable sites were detected and 13 haplotypes were defined in 38Cytbgene sequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.716 ±0.078 and 0.002 70±0.000 57.53 variable sites were detected and 21 haplotypes were defined in 40D-loopsequences.The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.906±0.034 and 0.006 27±0.000 99.The genetic distance among 13Cytbgene haplotypes varied from 0.001 to 0.014，and all haplotypes clusted one clade in the NJ phylogentic tree.The genetic distance among 21D-loophaplotypes varied from 0.001 to 0.019，and all haplotypes clusted two clades in the NJ phylogentic tree.Neutrality tests and mismatch distribution both indicated that it was stable forC.nasuspopulation in Lake Gaoyou in recent period.As a whole，the genetic diversity ofC.nasusin the Lake Gaoyou is relatively high，and it has the characteristics of high haplotype diversity and low nucleotide diversity.

Coilianasus；geneitc diversity；mitochondrial DNA；Cytbgene；D-loop

2017-07-03；

2017-08-17

江苏省海洋与渔业资源环保项目“江苏省水生生物资源重大专项(ZYHB16-3)”

李大命(1981- )，男，博士，副研究员，研究方向为渔业资源与环境。E-mail:ldm8212@126.com

潘建林。E-mail:Jianlinpan2006@126.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0003-06