MicroRNA-29b-3p重组腺相关病毒制备及在大鼠前额叶皮质中的表达研究*

李茂，冯建国，王晓斌，陈前修，万运强

（西南医科大学附属医院 麻醉科，四川 泸州 646000）

基础研究·论著

MicroRNA-29b-3p重组腺相关病毒制备及在大鼠前额叶皮质中的表达研究*

李茂，冯建国，王晓斌，陈前修，万运强

（西南医科大学附属医院 麻醉科，四川 泸州 646000）

目的 获得表达microRNA-29b-3p的重组腺相关病毒（rAAV-miR-29b-3p），并检测其在大鼠前额叶皮质中的感染效果和表达水平。方法 将前体miR-29b-3p基因片段置入AAV表达质粒中构建重组AAV质粒，将重组AAV质粒、包装质粒和辅助质粒通过脂质体LipaFiterTM共转染HEK293细胞包装rAAV-miR-29b-3p。从转染的HEK293细胞中收集并通过树脂柱纯化rAAV-miR-29b-3p，通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定rAAV-miR-29b-3p滴度。通过脑立体定位仪注射rAAV-miR-29b-3p至大鼠前额叶皮质，免疫荧光显微镜观察rAAV-miR-29b-3p的感染效果，qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p表达水平。结果 成功包装的rAAV-miR-29b-3p经纯化后获得了高纯度的rAAV-miR-29b-3p，qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p的病毒滴度达到1.0×1012vg/ml，经感染21 d后，脑组织前额叶皮质荧光表达明显，miR-29b-3p表达水平明显提高。结论 构建的rAAV-miR-29b-3p可使大鼠前脑皮层miR-29b-3p高表达，为进一步研究miR-29b-3p的生物学功能提供了有效工具。

腺相关病毒；miRNA-29b-3p；前额叶皮质；大鼠

MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码蛋白质的单链小RNA分子，能编码调控基因的转录。近年来研究表明miRNAs与膀胱癌、乳腺癌、结肠腺癌等肿瘤[1]，抑郁症、精神分裂症、焦虑症等精神疾病[2]的发生发展相关。前期研究结果发现氯胺酮抗抑郁作用可能通过 microRNA-29b-3p（miR-29b-3p）发挥作用（结果还未发表），然而具体机制不清楚。为了进一步研究miR-29b-3p的功能，克隆miR-29b-3p的基因片段以及高表达miR-29b-3p是重要的研究手段。重组腺相关病毒（recombination adeno-associated virus，rAAV）作为一种载体工具发挥着重要的作用。

本研究的目的是构建含有miR-29b-3p的重组腺相关病毒，并包装纯化病毒，然后通过脑立体定位仪注射rAAV-miR-29b-3p感染大鼠前额叶皮质，观察大鼠前额叶皮质感染效果及表达miR-29b-3p情况，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DNA提取试剂盒、质粒小提中量试剂盒、总RNA提取试剂盒购自中国天根生化科技公司，逆转录试剂盒购自美国Premega公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自德国Qiagen公司，XbaⅠ和AgeⅠ内切酶购自英国NEB公司，T4连接酶购自日本TaKaRa公司，pfu高保真酶购自中国天根生化科技公司，引物序列表内引物均购自生工生物工程上海有限公司，TOP10感受态细胞购自中国康 为 世 纪 公 司 ，pAAV-u6-IRES-hrGFP，pAAV-RC和pHelper质粒购自英国Cell Biolabs公司，人胚肾细胞系HEK293 cell、LipoFiterTM转染试剂购自中国汉恒生物科技公司，DMEM培养基、胎牛血清和胰酶购于美国Hyclone公司，滤膜滤器购自美国Millipore公司，SD大鼠由西南医科大学实验动物中心提供。

1.2 前体miR（pre-miR）的扩增

经查找miRBase基因组数据库（http：//www.mir base.org），发现在大鼠基因组上有3个基因位点可以编码miR-29b-3p的“茎环”结构，分别为rnomiR-29b-1（MI0000864，4 号染色体58100133 bp-58100053 bp）、rno-miR-29b-2（MI0000862，1 号染色体39612388 bp-39612468 bp）和rno-miR-29b-3（MI0031777，13号染色体118329450bp-118329530bp），本研究以rno-miR-29b-1的“茎环”结构为基础，正向延长81 bp以及反向延长100 bp，即基因组定位片段为1号染色体58100214~58099953 bp，作为 pre-miR-29b-3p的基因片段。然后，选用雄性SD大鼠，正常饲养1周后，用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后断颈处死，取出脑组织两侧前额叶皮质于灭酶EP管，放入液氮罐中，转入-80℃冰箱保存。本研究得到西南医科大学附属医院伦理委员会同意。将取得的前额叶皮质组织用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，以基因组为模板，用pre-miR-29b-3p的特异性引物rat-29-AgeⅠ-F和rat-29-XbaⅠ-R（见表 1），PCR 扩增出 miR-29b-3p的基因片段，PCR反应程序：95℃5 min，95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，32 个循环，72℃ 10 min。

1.3 重组质粒构建

用XbaⅠ和AgeⅠ内切酶同时酶切1.2中得到的pre-miR-29b-3p基因片段和pAAV-U6-IRES-hrGFP质粒，37℃酶切过夜，双酶切产物命名为：miR-29b-3p-DD，pAAV-U6-IRES-hrGFP-DD，T4连接酶 16℃连接60 min，将连接后的产物转化入TOP10感受态细胞中，37℃倒置培养12～16 h，次日挑取单个菌落，挑取的菌落进行菌落PCR，产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带，同时将挑取的菌落加入含有氨苄青霉素抗性的25 ml LB培养基，37℃摇菌过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒，提取质粒，进行双酶切鉴定，1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带，将菌落PCR和双酶切鉴定正确的菌落，送华大基因（中国重庆）测序，经序列比对，结果正确的重组质粒命名为pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP。

1.4 rAAV包装、纯化及滴度鉴定

HEK293细胞用DMEM培养基加入10%胎牛血清在5%的二氧化碳孵箱中培养，胰酶消化HEK293细胞，将细胞接种于培养皿中，80%～90%满即可进行转染。用LipoFiterTM转染试剂，将pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP重组表达质粒、pAAV-RC和 pHelper共转染到 HEK293细胞中，转染72 h后即可包装得到重组腺相关病毒rAAV-miR-29b-3p。收集所有细胞于15 ml离心管中并加入300μl的PBS，液氮及37℃水浴反复冻融3次，3 000 r/min离心5 min，收集病毒上清液，将病毒上清液于0.45μm滤膜过滤，树脂柱纯化后，最终得到纯化后的病毒约200μl，于-70℃保存，使用qITR-F和qITR-R引物（见表1）进行qRT-PCR滴度鉴定，标准品的拷贝梯度为 105、106、107、108、109和 1010，qRT-PCR 反 应 程序 ：95℃ ，10 min；40 个PCR 循环[95℃，10 s，60℃，60 s（收集荧光）]，根据 Ct值（average）和对应的拷贝数，做1元1次函数曲线，并换算成拷贝数10X及病毒滴度vg/ml。rAAV病毒滴度 =10X×40 000 vg/ml。

表1 引物序列表

1.5 rAAV-miR-29b-3p感染大鼠前额叶皮质

雄性SD大鼠15只，180～220 g，正常饲养1周后随机分为正常组5只：脑立体定位注射0.9%生理盐水（NS）；腺相关病毒实验组5只：脑立体注射rAAV-miRNA-29b-3p腺相关病毒；腺相关病毒对照组5只：脑立体注射携带rAAV-GFP腺相关病毒。主要操作步骤为：1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪上，以前囟为原点，根据大鼠脑立体定位图谱（Paxinos and Watson，2007）选定坐标，颅钻钻孔至脑膜见脑脊液流出，前额皮质坐标为：A/P+4.7 mm，M/L±2 mm，D/V-1mm，用2μl微量注射器吸取腺相关病毒2μl，以0.2μl/min的速度注射5 min，每侧注射1μl，每次留针10 min，缓慢出针，先行一侧注射，再按相同步骤行对侧注射，碘伏消毒切口，缝合皮肤，放回笼中继续饲养。21 d后，用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后断颈处死，取出脑组织，一侧大鼠脑前额叶皮质迅速冷冻切片，通过固定、核染色以及封片等处理后在荧光显微镜下观察荧光强度；另一侧大鼠脑前额叶皮质于灭酶EP管，放入液氮罐中，转入-80℃冰箱保存。

1.6 qRT-PCR

使用总RNA提取试剂盒一步法提取各组前额叶皮质大脑组织的总RNA，用miR-29b-3p的特异性逆转录引物Rno-miR-29b-3p-RT（见表1）逆转录生成cDNA，U6作为内参基因，其特异性逆转录引物为Rno-U6-RT（见表1）。将所有cDNA样品分别配置Real-time PCR 10μl反应体系，qRT-PCR反应程序：95℃，10 min；40 个 PCR 循环[95℃，10 s，60℃，60 s（收集荧光）]，扩增反应结束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s，建立 PCR 产物的熔解曲线，并从60℃缓慢加热到99℃，以样品miRNA-29b-3p的特异引物rno-miR-29b-3p-qF和内参（r no-U6）的特异引物 rno-miR-U6-qR及相同的rno-miR-qR引物（见表1），分别进行Real-time PCR反应，数据采用2-△△CT法进行分析。

1.7 免疫荧光

将冷冻切片4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，每次5 min，0.2%Tritox-100溶液作用15 min，PBS洗2次，每次5 min，加1%BSA封闭液室温作用30 min，PBS洗2次，每次 5 min，DAPI浓度1︰1 000室温作用5 min，PBS洗3次，每次5 min，封片，免疫荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 pre-miR-29b-3p扩增

根据对miR-29b-3p“茎环”结构序列的分析显示3个不同的“茎环”结构rno-miR-29b-1、rno-miR-29b-2、rno-miR-29b-3与成熟miR-29b-3p 比对具有相同的成熟miR-29b-3p序列（见图1A）；构建的pre-miR-29b-3p基因片段约280 bp，红色序列为“茎环”结构，红色序列中下划线的序列为成熟的miR-29b-3p的编码序列，整个基因序列两端下划线部分为引物序列（见图1B）。提取的大鼠前额叶皮质基因组经PCR扩展及纯化后经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，在250 bp处上方可见明显条带（见图2A），与预期的约300 bp基因片段大小相符。

图1 pre-miR-29b-3p扩增结果

2.2 pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP质粒构建结果

PCR目的基因产物与pAAV-U6-IRES-hrGFP载体质粒双酶切、连接后得到的重组质粒pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP（见图 2D），转化后得到的5个菌落，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后可见菌落编号为U6-5的菌落250 bp处上方有明显条带（见图2B）。菌落U6-5提取出的质粒经XbaI和AgeI双酶切、琼脂糖电泳后，在5 500 bp左右和250 bp上方有明显条带（见图2C）。对菌落U6-5质粒上重组片段进行基因测序和比对，比对结果与目的pre-miR-29b-3p基因序列完全一致（见图 2E）。

图2 pAAV-U6-miR-29b-3p-IRES-hrGFP质粒构建结果

2.3 rAAV-miR-29b-3p包装、纯化及滴度鉴定结果

根据qRT-PCR法测得得样品Ct值（见图3A），以每组AAV标准品的Ct值其对应拷贝数的对数做回归曲线，计算标准曲线的函数公式及R2值，通过函数公式计算待测AAV样品对应的拷贝数对数，换算成拷贝数10X及病毒滴度vg/ml，得到图3B标准曲线，计算rAAV-miR-29b-3p病毒滴度如下：rAAV-miR-29b-3p 滴度 =107.41×40 000=1.0×1012vg/ml。

图3 rAAV-miR-29b-3p滴度鉴定

2.4 大鼠前额叶皮质rAAV-miR-29b-3p感染情况

大鼠前额叶皮质冷冻切片，通过固定、核染色以及封片等处理后在荧光显微镜下观察到rAAV-GFP和rAAV-miR-29b-3p组绿色荧光表达明显，而正常组未见绿色荧光表达。见图4。

图4 大鼠前额叶皮质rAAV-miR-29b-3p感染情况 （×400）

2.5 rAAV-miR-29b-3p感染的前额皮质miR-29b-3p表达

qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p感染的前额皮质miR-29b-3p相对表达量，结果发现腺相关病毒实验组大鼠前额皮质miR-29b-3p表达水平较腺相关病毒对照组上调约4倍（见图5）。

图5 大鼠前额皮质miR-29b-3p相对表达量

3 讨论

抑郁症是一种慢性精神疾病，到2030年，将成为全球第一致残的疾病，严重影响患者生活质量，增加经济负担[3]。虽然目前已进行了很多研究，但具体与抑郁症相关的细胞和分子机制仍不清楚。目前在抑郁症与miRNA的研究已经证实miR与突触可塑性障碍、神经发生、单核苷酸多态性、应激以及多种抗抑郁药相关[4-7]。

与其他病毒相比，rAAV具有低免疫原性[8]，与逆转录病毒或者慢病毒不一样，rAAV不整合入宿主基因组[9]，还能快速使特定区域相关基因缺失[10]，因此rAAV比逆转录病毒或者慢病毒能更好研究基因缺失或者表达。rAAV具有不同的血清型，目前人的血清型有12种[11]，不同人源血清型对脏器组织的亲和力不同，对脑组织高的血清型是2、4、7～9、rh10，VINCENT[12]已经证实 AAV2/9 比 AAV2/2、AAV2/5更有效用于基因删除或者基因过表达，所以本研究中选择的血清型为AAV2/9型。随着AAV载体的不断发展完善，其在基因治疗中的应用也越来越广泛，目前rAAV相关的临床试验已经得到国际的广泛关注，AAV1、AAV2携带α1抗胰蛋白酶通过肌内注射治疗α1抗胰蛋白酶缺陷症处于临床Ⅰ、Ⅱ期；AAV2、AAVrh10携带CLN直接颅内给药治疗神经元蜡样质脂褐质沉积病处于临床Ⅰ期；AAV2携带囊性纤维化跨膜传导调节蛋白CFTR支气管喷雾给药治疗囊性纤维化病临床Ⅰ、Ⅱ期（共完成150个病例）；AAV2携带AADC、GAD、神经营养蛋白颅内给药治疗帕金森病（临床Ⅰ、Ⅱ期）等疾病[13-14]，并取得了较好的疗效。

本实验先根据miRBase数据库得到pre-miR-29b-3p基因片段大小约280 bp。大鼠基因组中编码miR-29b-3p“茎环”结构的基因位点有3个，理论上3个基因位点的“茎环”结构经过加工均可以形成成熟的miR-29b-3p。本研究选定了miR-29b-1的“茎环”结构作为扩增pre-miR-29b-3p的模板。提取大鼠的全基因组，PCR特异性扩增出miR-29b-3p基因，由于基因片段上带有酶切位点，因此miR-29b-3p的基因大小约300 bp与目的条带相吻合。双酶切目的基因和载体质粒，连接转化后菌落PCR，经琼脂糖凝胶电泳可以看到图2B中U6-5菌落条带在250bp上方，与miR-29b-3p目的基因大小吻合，为了再次确认U6-5菌落是不是真阳性菌落，双酶切该菌落的质粒，可以看到1条在250 bp上方，1条约5 500 bp，250 bp上方的条带是miR-29b-3p基因，5 500 bp条带是质粒骨架，为了明确U6-5菌落质粒上的基因序列，测序比对结果与基因库的miR-29b-3p基因序列完全一致，说明pre-miR-29b-3p构建和重组的质粒是成功的。

重组的质粒、辅助质粒、包装质粒，3质粒共转染HEK293细胞，纯化以后的病毒滴度达到了1.0×1012vg/ml，高于感染大鼠脑组织的最低浓度是1.0×109vg/ml，在理想的浓度1.0×1011～1.0×1013vg/ml之间[15]，适用于大鼠脑组织的感染。重组的腺相关病毒注射大鼠前额叶皮质21 d后可以看到明显的绿色荧光表达，说明载体质粒上的报告基因hrGFP已经表达绿色荧光蛋白，但是为了确定携带的premiR-29b-3p是否可以加工成成熟的miR-29b-3p及检测其表达水平，通过qRT-PCR检测到miR-29b-3p的表达水平，发现miR-29b-3p表达增强，表明构建的腺相关病毒成功感染脑组织并使miR-29b-3p表达增加。

目前在精神疾病方面通过AAV载体的基因治疗已经有很多报道，BAI[16]研究证明AAV-proBDNF感染大鼠海马可以上调抑郁样大鼠海马BDNF的水平，MARONGIU[17]通过AAV-sh-p11阻断P11基因的表达治疗帕金森大鼠，但是没有腺相关病毒携带miR基因治疗抑郁症的相关文献，本研究制备的rAAV-miR-29b-3p感染抑郁症模型大鼠前额叶皮质后，抑郁症大鼠行为学出现改变（数据未显示），这将为进一步研究miR-29b-3p的生理学功能以及抑郁症的基因治疗提供有效的手段与方法。

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（张蕾 编辑）

Construction of recombinant adeno-associated virus expressing miRNA-29b-3p and its expression in prefrontal cortex of rats*

Mao Li,Jian-guo Feng,Xiao-bin Wang,Qian-xiu Chen,Yun-qiang Wan
(Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To obtain the recombinant adeno-associated virus expressing miRNA-29b-3p(rAAV-miRNA-29b-3p),and examine the infection effect and expression level of rAAV-miRNA-29b-3p in the prefrontal cortex of rats.Methods The pre-miRNA-29b-3p gene fragment was inserted into AAV expression plasmid to construct a recombinant AAV plasmid.The recombinant AAV plasmid,packaging plasmid and helper plasmid were co-transfected into HEK293 cells by LipofiterTMfor rAAV-miRNA-29b-3p packaging.The rAAV-miRNA-29b-3p was harvested from transfected HEK293 cells and purified by a resin column,and the titer of the rAAV-miRNA-29b-3p was tested by qRT-PCR.The rAAV-miRNA-29b-3p was injected to the prefrontal cortex of rats using stereotactic apparatus.The infection effect was observed under immunofluorescence microscope,the expression level of miRNA-29b-3p was detected by qRT-PCR.Results High titer of rAAV-miRNA-29b-3p was obtained after successful packaging.The rAAV-miRNA-29b-3p was purified,the virus titer reached 1.0×1012vg/ml.Strong green fluorescence and high level of miRNA-29b-3p were detected in the infected prefrontal cortex after 21 days of infection.Conclusions The constructed rAAV-miRNA-29b-3p can greatly increase the expression level of miRNA-29b-3p in the prefrontal cortex of rats,which provides a useful tool for further study of the biological function of miRNA-29b-3p.

adeno-associated virus;miRNA-29b-3p;prefrontal cortex;rat

R338；R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.001

1005-8982（2017）25-0001-07

2016-12-24

国家自然科学基金（No：81271478）

王晓斌，E-mail：wangxiaobin67@163.com；Tel：13708280087