性别差异对磷脂转运蛋白基因敲除小鼠胆固醇逆转运效率的影响*

张颖，司艳红，秦树存

（泰山医学院 山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，山东 泰安271000）

性别差异对磷脂转运蛋白基因敲除小鼠胆固醇逆转运效率的影响*

张颖，司艳红，秦树存

（泰山医学院 山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，山东 泰安271000）

目的 观察磷脂转运蛋白基因敲除（PLTP-/-）后雌雄小鼠血浆脂质水平的差异，比较PLTP-/-对雌雄小鼠胆固醇逆转运（RCT）效率的影响。方法 选择8周龄同窝出PLTP-/-小鼠雌雄各8只，喂饲高脂饲料4周后，酶法检测小鼠血浆中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-Ch）和非高密度脂蛋白胆固醇（non-HDL-Ch）水平，Western blot检测血浆载脂蛋白A1（apoA1）表达，小鼠腹腔注射含3H-胆固醇的巨噬细胞，48 h后，取小鼠血浆、肝脏、胆汁、小肠和粪便，利用液闪计数仪检测小鼠各组织中的放射活度，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织清道夫受体BI（SR-B1）、低密度脂蛋白受体（LDL-R）、三磷酸腺苷结合转运蛋白G5/G8（ABCG5/G8）、肝X受体α（LXRα）、胆固醇7α羟化酶（CYP7A1）、小肠ABCG5/G8和肝x受体α（LXRα）的基因表达。结果 相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠血浆中TC、TG、HDL-Ch和non-HDL-Ch的表达无明显改变，但apoA1水平，差异有统计学意义（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高；体内RCT实验显示：与雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠血浆和小肠中放射活度无变化，肝脏、胆汁和粪便中放射活度，差异有统计学意义（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高；RT-PCR显示：与雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠肝脏中RCT相关因子LXRα、ABCG5/G8及CYP7A1表达，差异有统计学意义（P<0.05），雌性PLTP-/-小鼠升高，而SR-B1、LDL-R表达无明显变化；小肠壁LXRα、ABCG5/G8表达未见明显变化。结论 磷脂转运蛋白基因敲除后，雌性PLTP-/-小鼠的胆固醇逆转运效率较高于雄性PLTP-/-小鼠，肝脏中RCT相关蛋白基因表达增加。

磷脂转运蛋白；胆固醇逆转运；3H-胆固醇；性别差异

胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）是将外周组织细胞内的胆固醇通过血液循环以高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-Ch）的形式转运至肝脏，在肝脏转化为胆汁酸，最后以粪便的形式排泄出去的过程，可防止胆固醇在外周组织细胞的沉积。在RCT过程中，由于HDL介导了胆固醇从巨噬细胞中流出，促进了胆固醇逆转运而抑制了动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的发生和发展[1]。

磷脂转运蛋白（phospholipid transfer protein，PLTP）是参与HDL代谢和胆固醇逆转运的重要蛋白，它存在于各种组织细胞和血浆中，将磷脂从富含三酰甘油（Triglyceride，TG）的apoB脂蛋白颗粒净转运至HDL，从而影响体内HDL颗粒大小和功能活性[2]。研究证实，系统性PLTP缺乏可明显下调血浆HDL水平[3]，内源性或外源性PLTP缺乏可损伤三磷酸腺苷结合盒转运子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）介导的胆固醇从巨噬细胞流出[4-5]。前期实验证实，PLTP缺乏可抑制体内RCT效率[6]，但目前未见性别差异对RCT效率影响的相关报道，本研究针对上述问题进行探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low density lipoprotein，ac-LDL）根据文献方法制备，1，2-3H- 胆固醇购于美国PerkinElmer公司，Raw264.7巨噬细胞购于上海细胞生物研究所，RPMI 1640培养基和胎牛血清购于加拿大Giboc公司，TC、TG、HDL-Ch试剂盒购于北京普利莱生物科技有限公司，apoA1一抗均购自美国Abcam公司，QuantscriptRT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒、RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒、DNA酶I混合液购自德国QIAGEN公司承担，引物设计由生工生物工程上海有限公司，液闪计数仪美国Beckman Ls 6500。

1.2 动物分组与喂养

8周龄PLTP-/-鼠（雌雄各8只）由蒋宪成教授（美国SUNNY大学）提供，在温度为25℃和空气相对湿度为55%的适宜环境中，12/12 h光暗循环对动物高脂饲料（21%脂肪和0.15%胆固醇）喂饲4周。

1.3 LDL的乙酰化

取新鲜人血浆，超速离心技术提取LDL，浓缩至5 g/L，4℃条件下，在不含EDTA的生理盐水中透析24 h。冰浴中不断搅拌下，将1 ml饱和醋酸钠加入含有 1 ml LDL（5 mg）的试管内，再滴（2μl/滴）加7.5 mg醋酸酐（约LDL蛋白的1.5倍，30 min内滴加完毕），搅拌30 min后装入透析袋，4℃下透析24 h终止乙酰化。测得TBARS值为1.415，琼脂糖凝胶电泳显示迁移率增加了1倍，表明LDL被乙酰化，得到ac-LDL[7]。其中透析液组成：0.15 mol/L NaCl，0.3 mmol/L EDTA，pH7.4。

1.4 3H-胆固醇标记的巨噬泡沫细胞的培养

制备巨噬泡沫细胞[8]：Raw264.7巨噬细胞培养于RPMI1640培养基，加入5 mCi/L3H-胆固醇和100mg/Lac-LDL孵育24 h。收集细胞，胰酶消化离心，加入预冷PBS冲洗2遍，离心2 min（1 000r/min），使细胞悬浮于PBS，调整细胞数为1.2×1010个/L，置于冰上备用。吸取细胞悬液置于EP管（100μl/管）中离心，吸取上清液10μl，液体闪烁仪计数，重复3次。吸除剩余上清，加入200μl正己烷/异丙醇（3∶2），混匀，离心，将有机相真空干燥（抽提2遍），液体闪烁仪计数，计算细胞内和上清液记数的平均比例，细胞内应>95%。

1.5 小鼠体内胆固醇逆转运实验

高脂喂饲PLTP-/-鼠4周后，内眦取血100μl，离心取血浆，用于检测TC、TG、HDL-Ch和non-HDLCh。小鼠腹腔注射3H-胆固醇标记的巨噬泡沫细胞，48 h后检测血液中的放射活性：内眦取血离心10 min（2 500 r/min），取20μl血浆加入闪烁液10 ml，检测放射活性。小鼠禁食12 h后处死，取胆汁，加入闪烁液10 ml，检测放射活性。肝脏中放射活性的检测[9]如下：取肝脏组织，预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重匀浆，用正己烷/异丙醇（3∶2）萃取（重复3次），收集脂质层，真空冷冻干燥浓缩，检测放射活性。粪便中放射活性的检测[10]如下：取48 h内的粪便称重，在4℃超纯水中浸泡过夜（1 g/10 ml），次日加入等量乙醇匀浆，取200μl匀浆液进行放射活性检测。

1.6 血浆脂质和apoA1水平检测

酶法测定血浆中TC、TG和HDL-Ch水平，non-HDL-C水平由TC减去HDL-Ch获得。Western blot实验检测血浆中apoA1水平。

1.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）实验

取肝组织或小肠各50~100 mg，液氮中研磨成粉末，迅速加入1 ml Trizol液研磨得匀浆液。室温放置5 min，离心取上清，弃沉淀。上清液中加入200μl氯仿，拧紧离心管盖，用手剧烈震荡15 s，4℃离心15 min（12 000 r/min），分为 3 层，弃去中下层。取上层水相约400μl至EP管，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 10 min，4℃离心，12 000 r/min，15 min。弃去上清，将管壁和管底沉淀合并，加入DEPC水配制的75%乙醇1 ml洗涤沉淀，4℃离心5 min（7 500 r/min）。弃去洗液，沉淀室温干燥15～20 min，去离子水20μl（DEPC处理）溶解沉淀。取2μl原液置另一EP管中，加入98μl DEPC水，混匀。以DEPC水为空白对照，检测260 nm与280 nm波长下的 OD值，1 OD值=40μg RNA。OD260/280值>1.6的标本进行实验，在1.80～2.00范围内的视为纯度较高。取5μl总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取情况和完整性。另取10μg总RNA稀释于30μl DEPC水中，加入5μl DNA酶I混合液于37℃水浴40 min，再加入3.5μl 20 mmol/L的EDTA，75℃10 min灭活DNA酶活性。上述混合液分装在单个反应管中置于冰上，再加入模版RNA，彻底混匀（涡旋震荡时间不超过5 s），简短离心收集管壁残留液体，37℃孵育 60 min，采用 2-ΔΔCt方法实时定量mRNA水平，以基因相对β-actin数值作为表达数值。采用Rotor-gene Q软件Ver.1.7（Qiagen）。每个实验重复3次。见表1。

表1 RT-PCR所用引物序列

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLTP基因敲除对雌雄小鼠体重和肝重的影响

两组小鼠的体重和肝重数值见表2。高脂喂饲4周后，相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠的体重和肝重分别下降了19.152%和28.57%，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 高脂喂饲4周后雌雄PLTP-/-小鼠的体重、肝重及肝指数的变化 （n=8，±s）

表2 高脂喂饲4周后雌雄PLTP-/-小鼠的体重、肝重及肝指数的变化 （n=8，±s）

注：覮与雄性PLTP-/-小鼠比较，P<0.05

组别肝指数/%雄性PLTP-/-小鼠 4.999±0.28雌性PLTP-/-小鼠 4.416±0.22体重/g 肝重/g 28.204±1.51 1.410±0.22 22.805±2.32覮 1.007±0.20覮

2.2 PLTP基因敲除对雌雄PLTP-/-小鼠血脂的影响

高脂喂饲4周后，雌性PLTP-/-小鼠的TC、HDL-Ch、TG和non-LDL-Ch分别为61.701、16.722、103.011和 45.013 mg/dl，雄性PLTP-/-小鼠的 TC、HDL-Ch、TG和non-LDL-Ch分别为 65.721、18.533、102.403和48.511 mg/dl。与雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠上述指标均无统计学意义（P=0.091、0.112、0.553 和 0.080）（见图 1）。Western blot 检测雄性PLTP-/-小鼠apoA1表达量为0.49，雌性PLTP-/-小鼠apoA1为0.69，两两比较，雌性小鼠相比于雄性PLTP-/-小鼠表达升高了40.25%（见图2）。

图1 高脂喂饲4周后，雌雄PLTP-/-小鼠血脂的变化 （n=8，±s）

图2 高脂喂饲4周后，雌雄PLTP-/-鼠血脂中apoA1 的表达变化 （n=8，±s）

2.3 PLTP基因敲除对雌雄PLTP-/-小鼠胆固醇逆转运效率的影响

闪烁计数仪检测结果显示，雄雌性PLTP-/-小鼠血浆中放射活度分别为0.613和0.655，两者差异无统计学意义（P=0.212）。雌雄性PLTP-/-小鼠小肠中放射活度分别为2.723和2.822，两者比较，差异无统计学意义（P=0.072）。雄性PLTP-/-小鼠肝脏、胆汁和粪便中放射活度分别为3.112、0.282和4.031，雌性PLTP-/-小鼠肝脏、胆汁和粪便中的放射活度分别为6.024、0.514和8.012，相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠的放射活度，分别升高57.89%、66.67%和87.52%（见图3）。

2.4 PLTP基因敲除对胆固醇逆转运相关基因表达的影响

RT-PCR实验结果显示，雄性PLTP-/-小鼠的LXRα、ABCG5/G8、胆固醇7α羟化酶（cholesterol 7-alphahydroxylase，CYP7A1） 表达分别为 1.439、1.401、1.423和1.476，雌性PLTP-/-小鼠的LXRα、ABCG5/G8、CYP7A1 表达分别为 1.824、1.602、1.614 和 1.735。相比于雄性PLTP-/-小鼠，雌性PLTP-/-小鼠肝脏中上述指标均差异有统计学意义（P=0.016、0.023、0.034和0.014），表达上升。SR-B1、LDL-R表达差异无统计学意义（P=0.073和 0.105）（见图 4A），而LXRα、ABCG5/G8在雌雄PLTP-/-小鼠小肠中表达差异无统计学意义（P=0.077、0.125和 0.081）（见图4B）。

图3 PLTP-/-雌雄小鼠对胆固醇逆转运效率的影响（n=8，±s）

图4 胆固醇逆转运相关基因mRNA在PLTP-/-雌雄小鼠肝脏（A）与小肠（B）中的表达 （n=8，±s）

3 讨论

RCT是胆固醇与脂蛋白代谢的重要途径，1973年由GLOMSET等[11]首次提出，亦称为传统的RCT路线。其过程如下[1]：首先，胆固醇经外周细胞膜上的转运体流出到apoA-1或HDL上。血液中HDL颗粒上的部分胆固醇酯可与LDL、VLDL或乳糜微粒上的TG或磷酯（PL）进行交换，前者依靠胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）介导，后者依靠PLTP介导。PLTP不仅介导PL转移，还使中等大小的α-HDL融合成大的HDL，释放贫脂apoA-l，从而促进外周胆固醇转运。其次，HDL随血液循环到达肝脏，结合特异性受体SR-B1，HDL携带的胆固醇转运至肝脏。肝脏中的胆固醇可经CYP7A1催化转变成胆汁酸，胆汁酸经ABCB4/B11外排至胆管，经胆汁进入肠道排出；肝脏中的胆固醇亦可直接经ABCG5/G8转运至胆汁中，进而经粪便排出体外。

实验证实性别差异影响了PLTP-/-小鼠体内RCT效率。同位素示踪实验显示：与雄性PLTP-/-小鼠相比，雌性PLTP-/-小鼠肝脏、胆汁和粪便中3H-胆固醇升高，而肠壁中3H-胆固醇含量无明显变化，这提示雌性小鼠经肝脏途径RCT效率增高，而经肠道直接排出效率与雄性小鼠差异无统计学意义。荧光定量PCR实验发现：雌性小鼠肝脏中ABCG5/G8及CYP7A1表达升高，这表明，小鼠主要以肝脏直接排泌或以胆汁酸形式排泌胆固醇。本实验亦证实雌性小鼠肝脏LXRα表达升高。LXRα是配体活化的转录因子，在体内RCT调控中起着十分重要的作用。LXRα-ABC通路在RCT过程中具有重要调控作用，LXRα通过对ABC超家族中ABCA1、ABCG1、ABCG5/G8等的表达调节直接调控细胞胆固醇代谢。与肠道3H-胆固醇表达无变化相对应，影响肠壁胆固醇排泌的转运蛋白ABCG5/G8及其上游调节转运子表达无变化。

PLTP是调节HDL代谢的重要蛋白之一，其表达变化影响HDL介导的RCT的多个环节。但性别差异对PLTP-/-鼠RCT功能的影响未见报道。已有实验证实雌激素对心血管疾病具有保护作用，其抗AS的机制大多与调节血管内皮、血管平滑肌、血脂及抗凝血等作用有关[12]。前期实验证实，PLTP缺乏后降低了HDL中鞘氨醇磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）的含量[13]，并且 S1P 是 HDL心血管保护作用的重要介质[14-15]，因此，雌性血浆HDL在心血管内皮的保护作用极有可能与雌性激素调节S1P水平有关。其相关机制，有待进一步深入研究。

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（张蕾 编辑）

Effect of gender difference on reverse cholesterol transport efficiency in PLTP-/-mice*

Ying Zhang,Yan-hong Si,Shu-cun Qin
(Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong,Taishan Medical University,Taian,Shandong 271000,China)

Objective To compare the effects of phospholipid transfer protein gene knockout(PLTP-/-)on reverse cholesterol transport effiency,and observe the changes of plasma lipids in male and female PLTP-/-mice.Methods In this study 8 male and 8 female 8-week littermate PLTP-/-mice were selected and fed with high-fat diet for 4 weeks.Then plasma lipids such as total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)and non-high density cholesterol(non-HDL-C)were detected by an enzymatic method.The plasma level of apolipoprotein A1(apoA1)was analyzed by Western blot.Then all mice were injected intraperitoneally with3H-cholesterol labeled macrophages and the appearance of3H-tracer in plasma,liver,bile,intestinal wall and feces over 48 h was determined by liquid scintillation counter.The mRNA expressions of scavenger receptor class B type 1(SR-B1),low density lipoprotein-receptor(LDL-R),ATP-binding cassette transporter G5/G8 (ABCG5/G8),liver X receptor α (LXRα)and cholesterol 7α-hydroxylase A1(CYP7A1)in liver,and ABCG5/G8 and LXRα in intestinal wall were determined by RT-PCR.Results Compared with the male PLTP-/-mice,the expressions of TC,TG,HDL-C and non-HDL-C in the female PLTP-/-mice were not obvious changed,the expression of apoA1 was increased significantly(P<0.05).The isotope tracing experiment showed3H-cholesterol of plasma and intestine had no differences between the female and male mice;3H-tracer of liver,bile and feces was increased significantly(P<0.05).Meanwhile,RT-PCR analysis showed the mRNA expressions of LXRα,ABCG5/G8 and CYP7A1 in the liver were up-regulated significantly in the female mice compared with the male mice(P<0.05),while the mRNA expressions of SRB1 and LDL-R in the liver and LXRα and ABCG5/G8 in the intestinal wall were not different between the female and male mice(P>0.05).Conclusions Reverse cholesterol transport efficiency is higher and the mRNA expressions of the genes related to reverse cholesterol transport in liver are also significantly higher in the female PLTP-/-mice than in the male PLTP-/-mice.

phospholipid transfer protein;reverse cholesterol transport;3H-cholesterol；gender difference

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.003

1005-8982（2017）25-0013-06

2016-10-12

山东省自然科学基金（No：ZR2013HL063）；山东省泰山学者岗项目（No：ts20151105）