某院348株铜绿假单胞菌耐药性分析及多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因检测

王桂东 ，王晓燕 ，马璨粲 ，高秀展 ，孙学春

（1.山东省临沂市肿瘤医院 检验科，山东 临沂 276001；2.山东省临沂市人民医院 检验科，山东 临沂 276000）

某院348株铜绿假单胞菌耐药性分析及多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因检测

王桂东1，王晓燕1，马璨粲1，高秀展1，孙学春2

（1.山东省临沂市肿瘤医院 检验科，山东 临沂 276001；2.山东省临沂市人民医院 检验科，山东 临沂 276000）

目的 研究该院检出的348株铜绿假单胞菌（PAE）耐药性及多重耐药PAE耐药基因检测。方法将血液科检出348例PAE菌株进行体外耐药监测，并对其中36株多重耐药PAE菌株进行耐药相关基因OprD2、VIM、GIM、SPM、IMP-1、TEM、VEB、PER、aac（3）-Ⅲ、aac（6）’-Ib-Cr、qnrA、qnrS、qnrD检测。结果多重耐药PAE对妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南比较敏感，对其他临床常用抗生素均有明显的耐药性，PCR基因分析结果显示，OprD2和IMP-1基因阳性率分别为97.22%和94.44%，aac（3）-Ⅲ和aac（6）'-Ib-Cr阳性率分别为 38.89%和 27.78%，TEM 阳性率为 75.00%，qnrA、qnrS和qnrD阳性率为 50.00%、61.11%和47.22%，其他基因低于15.00%。结论 PAE耐药性较强，多重耐药PAE耐药基因主要为OprD2和IMP-1基因。

铜绿假单胞菌；耐药基因；耐药机制；血液科

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）作为院内感染常见的条件致病菌之一，常导致免疫功能不全的患者和抵抗力明显低下患者发生明显菌血症，严重可致使患者死亡[1-2]。多重耐药PAE菌株的研究发现[3-4]，其基因结构易发生变化，常携带一种或者几种抗药基因，因此，PAE患者易发生耐药性，给抗感染治疗带来较大困难。血液科部分患者如白血病、多发性骨髓瘤和霍奇金病等抵抗力较为低下，PAE作为条件致病菌易侵犯抵抗力低下和进行侵袭性操作患者，故血液科易并发PAE院内感染。目前，对PAE感染的耐药性基因型研究分析仍较少，因此，应充分了解PAE在血液科传播的流行特征和耐药性基因结构特点，以便采取更为有效的防治措施。本研究对血液科检出的PAE菌株进行体外药敏实验检测，并对其中的15例多重耐药菌株进行耐药基因的分型检测，以便从分子水平认识PAE多重耐药性的相关分子机制。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

PAE菌株全部分离自2013年1月-2015年12月临沂市肿瘤医院血液科患者的痰、中段尿、血液、骨髓、腹水等标本，所有菌株采用法国生物梅里埃VITEK2-compact鉴定。质控菌株购自卫生计生委临床检验中心的PAE ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603等。

1.2 药物敏感实验

采用K-B法进行药物敏感实验，MH平板购自法国生物梅里埃公司，药物敏感纸片和抗生素均购自英国Oxoid公司。主要检测抗生素有庆大霉素、阿米卡星、四环素、妥布霉素、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南。

1.3 仪器与试剂

实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）扩增仪采用 ROCHE LC480，凝胶成像系统采用BIO，电泳为Biorad mini-4电泳仪，琼脂糖和部分其他试剂均购自美国Sigma公司。PCR引物和DNA marker由上海生物生工有限公司合成提供（见表1）。PCR试剂盒由凯杰生物工程（深圳）有限公司提供。

表1 耐药基因PCR引物序列及目的产物长度

1.4 细菌基因组DNA模板的制备及细菌DNA的提取

用接种环挑取纯菌落接种于5 ml LB肉汤培养液，将装有LB培养液的试管置于震荡培养箱中，37℃，200 r/min，18～20h培养至细菌生长对数期，然后取3 ml培养液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书进行操作，提取的DNA模板于-20℃保存备用。

1.5 耐药基因的检测

各种靶基因PCR扩增体系均为：总反应体积20μl，其中 P1、P2 引物各 1μl，Premix Taq DNA 聚合酶 10μl，灭菌蒸馏水 7μl，模板液 1μl。热循环参数为：90℃预变性 4 min，93℃变性 50 s、55℃退火50 s、72℃延伸 60 s，40 个循环后 72℃延伸 6 min；用双蒸灭菌水作模板设阴性对照。反应结束后取5μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸染液染色，同时加核酸电泳相对分子质量标准鉴定扩增DNA片段的大小。用凝胶成像系统观察结果并照相分析。

1.6 统计学方法

对348例患者进行回顾性调查分析，计数资料用率（%）来表示。

2 结果

2.1 药物敏感实验结果

PAE对抗生素的药物敏感实验结果显示，多重耐PAE对氨基糖苷类的阿米卡星与喹诺酮类的左氧氟沙星耐药率相对较低，分别为19.83%和20.98%，β-内酰胺酶类、头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶与酶抑制剂复合物等抗菌药物的耐药率均>70%，提示实验菌株包含不同种类的耐药基因。见表2。

2.2 耐药基因分析结果

36例多重耐药菌株real-time PCR定量分析显示，OprD2和IMP-1基因阳性率分别为97.22%和94.44%，aac（3）-Ⅲ和aac（6）’-Ib-Cr阳性率分别为38.89%和 27.78%，TEM阳性率为 75.00%，qnrA、qnrS和qnrD阳性率为50.00%、61.11%和47.22%，其他基因低于15.00%。见表3。

表2 348株PAE对17种抗生素的耐药性

表3 36例多耐药的PAE耐药基因检测阳性率

3 讨论

随着人类对抗生素新药物的不断研发以及抗生素滥用，条件致病菌PAE在院内感染的检出率越来越多。血液科患者常抵抗力低下、部分患者进行大剂量放化疗或者激素应用使得机体免疫力降低，并且常有部分侵袭性操作如骨髓穿刺等，综合这些因素易导致血液科发生PAE感染，病情复杂而难控制[5-6]。通过对本院血液科患者标本的分析显示，PAE对各种抗生素（除亚胺培南和美罗培南）的耐药率为30%左右，其他药物耐药率均达到60%以上，部分抗生素耐药率达到95%以上。为此，亟需对血液科PAE的耐药基因型进行分析，以便更好地进行检测和应用抗生素进行早期的控制。

相关研究发现[9]，PAE通过产酶、膜孔蛋白缺失、泵出机制、生物膜形成、青霉素结合蛋白结构改造等机制使其自身获得耐药性。本研究发现，OprD2基因型的阳性率为97.22%，且PAE对亚胺培南的耐药率达到90%以上，可见，在该院血液科PAE对亚胺培南的耐药的机制与OprD2的缺失存在相关性，主要是因为OprD2作为膜上的一种孔道蛋白具有配体特异性，可以特异性结合亚胺培南，从而有助于发挥抗菌药性[7-8]。由于这种特异性结合的存在，β-内酰胺类抗菌药物很难通过，故其与碳青霉烯类抗菌药物常无明显的交叉耐药性。此外，本研究检测4种金属酶基因发现仅有IMP-1的阳性率为94.4%，其余VIM、GIM、SPM的阳性率较低，可见PAE对碳青霉烯类耐药的机制可能与金属酶存在相关性。既往研究发现[10-12]，PAE对碳青霉烯类等多种抗生素产生多重耐药的重要机制就是PAE分泌金属酶。金属酶为异基因家族构成，其酶蛋白的一级结构的相似性较低，而三级和四级的空间结构存在高度的一致性，且金属酶依赖于锌离子可以降解碳青霉烯类抗生素，对单环列抗生素和螯合剂敏感等特点。

PAE对氨基糖苷类抗菌药物的耐药率均在90%以上，进一步分析发现氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ⅲ、aac（6）’-Ib-Cr的阳性率均达到 90%以上，二者均可以通过对氨基糖苷类抗菌药物的修饰产生抗药性，并且aac（6）’-Ib-Cr对喹诺酮类抗菌药物也存在修饰作用，从而产生多重耐药性[13-15]。

本研究中对质粒介导的qnr基因诱导产生氟喹诺酮类耐药的阳性检出率达到50%以上，主要以qnrS型基因为主，为此本研究中同样检测到PAE对氨基糖苷类药物的耐药性。此外PAE具有广谱的β-内酰胺类抗生素耐药性，耐药率均达到90%，且检测TEM、VEB、PER等基因型，但具体的机制有待进一步研究。

综上所述，PAE耐药性较强，多重耐药PAE耐药机制复杂，耐药基因最常见为OprD2和IMP-1基因。

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（张蕾 编辑）

Analysis of drug resistance of 348 strains ofPseudomonas aeruginosain our hospital and detection of drug resistance genes ofPseudomonas aeruginosa

Gui-dong Wang1,Xiao-yan Wang1,Can-can Ma1,Xiu-zhan Gao1,Xue-chun Sun2
(1.Clinical Laboratory,Linyi Tumour Hospital,Linyi,Shandong 276001,China;2.Clinical Laboratory,Linyi People's Hospital,Linyi,Shandong 276000,China)

Objective To investigate the drug resistance of 348 strains ofPseudomonas aeruginosa(PAE)and detection of drug resistance genes of multidrug-resistant PAE in our hospital.MethodsIn vitroresistance monitoring was performed in 348 strains of PAE isolated in the Department of Hematology.In the 36 multi-drug resistant strains of PAE,RT-PCR was used to determine drug resistance genes which includedOprD2,VIM,GIM,SPM,IMP-1,TEM,VEB,PER,aac(3)-III,aac(6)'-Ib-Cr,qnrA,qnrS and qnrD.Results Multidrug-resistant PAE strains were highly sensitive to Tobramycin,Piperacillin/Tazobactam,and Meropenem,but were obviously resistant to other commonly-used antibiotics.PCR analysis showed that the positive rates ofOprD2,IMP-1,TEM,qnrS,qnrA,qnrD,aac(3)-III and aac(6)'-Ib-Crgenes were 97.22%,94.44%,75.00%,61.11%,50.00%,47.22%,38.89%and 27.78%respectively,while the positive rates of others genes were less than 15.00%.Conclusions Drug resistance ofPseudomonas aeruginosais strong,and the resistance genes of multidrug-resistantPseudomonas aeruginosaare mainlyOprD2andIMP-1genes.

Pseudomonas aeruginosa;resistance gene;resistance mechanism;Department of Hematology

R446

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.25.025

1005-8982（2017）25-0119-04

2016-10-28