规模化猪场暴发塞内加谷病及SVV HN16株的分离鉴定

贺东生，罗天霞，苏丹萍，徐帅飞，熊景峰

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642）

规模化猪场暴发塞内加谷病及SVV HN16株的分离鉴定

贺东生，罗天霞，苏丹萍，徐帅飞，熊景峰

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642）

2016年3月，华南某猪场发生水疱性疾病。经实验室PCR诊断，排除FMDV后显示为SVV阳性。使用PK-15细胞进行病毒培养和传代，采用特异性的VP1基因引物扩增该片段，使用DNAMAN7．0和MEGA6．06软件进行同源性分析。结果表明，该病毒可以在细胞上成功繁殖，成功克隆了该病毒的VP1基因，序列长度为694 bp，并进行基因测序和遗传进化分析。序列同源性分析显示：该毒株与国内其他毒株亲缘关系较远，单独形成一个分支。表明该毒株为塞内加谷病毒的新成员，命名为SVV HN16。

猪；塞内加谷病毒；分离鉴定；序列分析

塞内加谷病毒（Seneca Valley virus，SVV)又名塞内加A病毒（Senecavirus A，SVA），为单股正链不分节的RNA病毒，隶属小RNA毒科Senecavirus病毒属。症状与口蹄疫相似，其主要通过感染仔猪使其猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。该病毒最早于1998年被分离[1]到，因其在2014年巴西大规模暴发才被养猪业所重视[2]。2015年3月，该病首次在我国广东某猪场暴发，并从发病病料分离到了SVV[3]。2016年3月华南某集约化猪场肉猪和母猪群暴发水泡性疾病，发病率100%、病死率约40%。发病猪的病料经多项技术和实验排除了FMDV、SVD等类似病原存在，证实这是一起单纯SVV引起的暴发，并对该病毒进行细胞培养和分离鉴定，为该病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与细胞系

本研究从华南某猪场（2 500头基础母猪）3～7日龄的乳猪中，采集鼻吻、蹄冠部位出现水疱样病变的仔猪内脏及水疱液，按1∶3加入PBS缓冲液进行稀释研磨，6 000 g， 4 ℃离心5 min，取上清，于-80 ℃冰箱储存备用。PK-15传代细胞系由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。

1.2 主要试剂

One-step RT-PCR试 剂 盒、DNA Marker、dNTP、 Taq 酶 等 购自宝生物工程（大连）有限公司，pMD18-T载 体、DH5α 感 受 态 细胞、Trizol试剂、质粒提取试剂盒购自Omega公司，DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司，CO2培养箱、DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购自赛默飞世尔仪器有限公司，倒置显微镜为徕卡仪器有限公司，其他所用化学试剂都为分析纯。引物合成、DNA测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.3 引物设计与合成

本实验室根据GenBank 所发布的序列号，选择全基因序列，运用Primer Premier5.0针对SVV、FMDV（O、A、Asia1通用检测型）分别设计引物，扩增片段分别为700 bp和350 bp，退火温度分别为58 ℃和54 ℃。引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.4 总RNA 的提取

将病料离心后取出上清，按Trizol法提取病毒总RNA，然后用无RNA酶的去离子水溶解，-80 ℃冰箱保存。具体步骤参照Trizol试剂说明书。

1.5 病毒的RT-PCR 检测

以病毒总RNA为模板进行RTPCR 扩增，反应体系为：Onestep RT-PCR buffer 12.5μL， 上 下游引物各 1.0μL，RNA 模板 3μL，Rnase Free DH2O7.5μL。PCR 扩 增程序为：50 ℃ 30 min ；95 ℃预变性5 min ；95 ℃变性 30 s；54 ℃退火 3 s；72 ℃延伸 30 s，30个循环 ；72 ℃延伸 10 min ；4 ℃保存。取 5μL PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，CLINX凝胶成像系统拍照观察。

1.6 病毒的分离

取离心后保存的上清液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，取适量过滤后的病毒液加入到铺满单层细胞的细胞板上。37 ℃温箱孵育60 min，再加入2%血清培养的DMEM37 ℃，培养48 h后收毒。在下一次传代前，先将细胞培养物反复冻融3次，取上清液接种细胞进行传代，在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)并记录。

1.7 克隆测序

将阳性PCR 产物经纯化回收后与PMD-18T 载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后挑单个菌落进行PCR鉴定，鉴定成功的重组质粒送往睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

1.8 序列分析

将RT-PCR 扩增获得的基因片段进行克隆、测序，利用DNAMAN7.0和MEGA6.06软件处理，与GenBank上已公布的SVV毒株的全基因序列进行同源性比对分析，并绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病料RT-PCR 检测结果

以提取的总RNA为模板，用SVV和FMDV引物分别对样品进行以上2种病毒的检测。结果如图1所示，FMDV检测结果为阴性，SVV 在700 bp左右有明显条带，检测结果为阳性。由此说明该病毒为SVV而非FMDV。将SVV VP1基因PCR产物纯化后构建至pMD-18T质粒并进行测序。

2.2 SVV CH_GDHS_2017的分离

病毒接种单层PK-15细胞，24 h时开始出现病变，48 h收毒。随着传代次数的增加，出现CPE的时间缩短且程度随之加剧。目前病毒已传至第8代，基本能在该细胞系上稳定增殖。病毒传至24 h时有细胞变圆，折光性变强，有较多漂浮的死细胞；而对照细胞生长良好(图2A，2B)。培养48h，细胞CPE达75%以上，细胞基本变圆且有大量漂浮的死细胞；对照仍是致密的单层细胞，只有少量的细胞漂浮在液面（图2C，2D）。每隔2代进行PCR检测，结果均为阳性。由此，可以确定成功分离了一株SVV HN16毒株。

2.3 SVV VP1基因同源性分析

将测序结果在NCBI中进行BLAST，结果显示其与GeneBank中已发表序列同源性高达99%，由此进一步确定其为SVV，将其命名为SVV HN16。以GenBank中已发表的13株SVV毒株为参考（表1），进行SVV VP1基因同源性分析（图3）。结果显示， SVV HN16 VP1基因之间核苷酸序列同源性为85%～96.9%：其中与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为94.7%～95.1%；与巴西毒株相比核苷酸同源性为93.9%～96.9；与美国毒株核苷酸同源性为85.0%～86.5%.巴西毒株与国内毒株相比，同源性为95.9%～97.2%。该毒株与巴西毒株同源性最高，为96.9%，与美国毒株同源性最低，为85.0%。

图1 SVV VP1基因PCR扩增结果

图2 A为接毒24 h；B为对照24 h；C为接毒48 h；D 为对照 48 h

表1 GenBank已登录的svv参考毒株

图3 基于SVV VP1基因的序列同源性

图4 基于SVV VP1基因的遗传进化树

2.4 基于SVV VP1基因的遗传进化分析

以表1中13株毒株为参考，运用MEGA6.06软件采用Neighbor-Joining聚类分析方法构建基于VP1基因序列的进化树。如图4所示，SVV HN16与国内毒株亲缘关系较近，而与美国毒株较远。本次鉴定毒株与国内其他毒株虽然亲缘关系较近，但单独形成一个分支，说明该病毒是SVV新成员。

3 讨论

SVV 最初分离自细胞培养基，怀疑有可能来自猪胰蛋白酶或胎牛血清[1]。在2007年，SVV在美国和加拿大的猪群中被分离[4]到，在美国和巴西等地，该病毒仅有零星报道，直至2014年11月到2015年4月，巴西出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐渐被重视[5]。在2015年9月，该病在美国某猪场暴发，并伴随大量新生仔猪死亡[6]。在2016年，国内首株塞内加谷病毒被报道[3]， 该病开始传入我国并威胁着我国的养猪业。

本次鉴定出的SVV HN16与国内其他毒株不在一个分支，表明在进化过程中变异迅速，这种变异对疾病的防治和疫苗的研究增加了难度。对该病毒使用细胞进行增殖，目前已传至第8代，且能出现稳定的病变，有望对新疫苗的研制提供帮助。因该病是猪场新病，对其认知比较有限，且发病率较高、传播快、猪场损失大，对猪场短期及长期的影响难以预估，需要进一步研究其传入源头、防控方法，做好防控方案。

致谢：本实验是在华南农业大学兽医学院、人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室和广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室完成。感谢广东省生猪产业体系创新团队基金的资助。

[1] FALLAUX F J， BOUT A， VAN DER VELDE I， et al. New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses [J]. Hum Gene Ther，1998， 9(13)： 1909-1917.

[2] VANNUCCI F A， LINHARES D C，BARCELLOS D E， et al. Identification and complete genome of Seneca Valley virus in vesicular fluid and sera of pigs affected with idiopathic vesicular disease， Brazil [J].Transbound Emerg Dis，2015， 62(6)： 589-593.

[3] 赵晓亚，伍绮文，伍子娴，等.国内首株猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)的分离鉴定[J].中国预防兽医学报 ，2016，38(11)：839-843.[2017-08-21].

[4] REDDY P S， BURROUGHS K D，HALES L M， et al. Seneca Valley virus， a systemically deliverable oncolytic picornavirus， and the treatment of neuroendocrine cancers [J]. J Natl Cancer Inst， 2007，99(21)： 1623-1633.

[5] LEME R A， Zotti E， Alcantara B K，et al. Senecavirus A： An emerging vesicular infection in Brazilian Pig Herds [J]. Transbound Emerg Dis，2015， 62(6)： 603-611.

[6] CANNING P， CANON A， BATES J L， et al. Neonatal mortality，vesicular lesions and lameness associated with Senecavirus A in a U.S.sow farm[J]. Transbound Emerg Dis，2016，63(4)： 373-378.

2017-08-31)