丹参水溶性成分丹酚酸A对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的防治作用及机制

吴雄健++++++郑虹++++++朱海燕++++++毛忠懿++++++谢军

[摘要]目的 探讨丹参水溶性成分丹酚酸A对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的防治作用及机制。方法 选取成年健康雄性SD大鼠48只，隨机分为假手术组、模型组、丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1），每组各12只。除假手术组外均注射CCl4制作大鼠肝纤维化模型。丹酚酸A组于造模8周后给予丹酚酸A 10 mg/（kg·d）腹腔注射，Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）于造模8周后予以DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射，而假手术组和模型组均于造模8周后予以等量生理盐水腹腔注射。给药治疗6周后，处死各组实验动物，收集肝右叶中部两块肝组织进行检测，其中一块利用10%的甲醛进行固定并制备石蜡切片；另一块置于-70℃冰箱中保存备用，用于分子生物学检测。结果 经Western blot检测发现，模型组的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平。模型组的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平。模型组的Gsk3β、β-catenin表达水平显著高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显著低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调Gsk3β、β-catenin的表达水平。结论 丹酚酸A可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来抑制肝纤维化。

[关键词]肝纤维化；大鼠；丹参；丹酚酸A

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）10（b）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the preventive effect and mechanism of salvianolic acid A of water-soluble component from Salvia miltiorrhiza on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats.Methods 48 adult male SD rats were selected and randomly divided into the sham group，the model group，the salvianolic acid A group，and the Wnt channel blocker group （DKK-1），with 12 rats in each group.Except the sham group，the CCl4 was injected in other three groups to establish hepatic fibrosis model in rats.In the salvianolic acid A group，10 mg/（kg·d） salvianolic acid A was intraperitoneally injected after 8-week modeling.In the Wnt channel blocker group，the DKK-1 and 10 mg/kg salvianolic acid A were intraperitoneally injected after 8-week modeling.For the sham group and the model group，the same volume of saline was intraperitoneally injected after 8-week modeling.The rats were sacrificed 6 weeks after medications.Two liver tissues from the middle of the right lobe of the liver were collected for test.One of them was fixed with 10% formaldehyde and prepared into paraffin sections.The other one was stored in a refrigerator at -70℃ for molecular biological detection.Results By Western blot detection，the expression of α-SMA，TIMP-1 and Collagen Ⅰ proteins in the model group was significantly higher than that in the sham group，while in the salvianolic acid A group and Wnt channel blocker group，the proteins expression mentioned above could be obviously down-regulated after the corresponding therapy.In the model group，the expression levels of α-SMA，MMP-2，TIMP-1，Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA were much higher compared with those in the sham group，while in the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，these indexes were greatly down-regualted after the related therapy.The Gsk3β and β-catenin expression levels in the model group were much higher than those in the sham group.The β-catenin expression level was extremely higher than that in the sham group.In the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，after the corresponding therap，the Gsk3β and β-catenin expression levels could be significantly down-regulated.Conclusion Salvianolic acid A may inhibit hepatic fibrosis by activating Wnt/β-catenin signal pathway.endprint

[Key words]Hepatic fibrosis；Rat；Salvia miltiorrhiza；Salvianolic acid A

肝纖维化是各种慢性肝炎发展为肝硬化的必经病理阶段，严重影响肝脏的功能[1]，因此，采取有效药物治疗手段抑制或逆转肝纤维化至关重要[2]。肝纤维化的发病机制很复杂，涉及多条信号通路的改变以及多种蛋白表达水平的变化。研究显示，Wnt/β-catenin信号途径与肺及肾纤维化的形成密切相关，但该通路与肝纤维化的关系尚不明确[3]。本研究利用丹酚酸A对大鼠肝纤维化模型进行干预治疗，观察丹酚酸A对四氯化碳（CCl4）致实验性肝纤维化大鼠肝组织表达的影响，旨在为治疗肝纤维化寻求新的治疗靶点。

1材料与方法

1.1材料

成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，体重200 g左右，均由广东省农业科学院动物卫生研究所提供，许可证号：SYXK（粤）2016-0165。除假手术组外，大鼠轮替背部皮下及四肢内侧注射40% CCl4橄榄油混悬液3 ml/kg体重，每周2次，共8周，以建立肝纤维化动物模型。

1.2方法

1.2.1分组及给药 造模后8周，对大鼠实施随机分组，分为假手术组、模型组、丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1），每组12只，并进行不同的处理，各组具体给药方式如下：假手术组和模型组单纯采用等量生理盐水腹腔注射；丹酚酸A组于造模8周后予丹酚酸A（苏州巨能世纪信息科技有限公司）10 mg/（kg·d）腹腔注射；Wnt通道阻滞剂组（DKK-1，由上海江莱生物科技有限公司提供）于造模8周后予DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射。

1.2.2标本采集 给药治疗6周后，处死各组实验动物，收集各组肝组织，称取肝脏湿重，并切取肝右叶中部2块肝组织进行检测，其中一块利用10%的甲醛（上海江莱生物科技有限公司）进行固定，制备石蜡切片；另一块置于-70℃冰箱（由河北国辉实验仪器有限公司提供）中保存备用，用于分子生物学检测。

1.2.3观察指标与检测 ①肝纤维化相关指标的检测：采用HE染色分析肝纤维化的程度，采用Isak评分系统对肝纤维化程度进行评分，采用免疫组化法观察大鼠肝组织中MMP-2、TIMP-1、Tcf-4、α-SMA的表达，采用RT-PCR检测大鼠肝组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA的表达情况。②Wnt/β-catenin信号通路相关指标的检测：采用免疫组化法观察大鼠肝组织中β-catenin的表达，采用Western-blot检测大鼠肝组织中β-catenin蛋白的表达，采用RT-PCR检测大鼠肝组织中GSK-3β、β-catenin、Wntl、Wnt3α、Wntlob mRNA的表达情况。

1.3统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对实验相关数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1四组α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白表达水平分析

经Western blot检测发现，模型组的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平（图1）。

2.2各组α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平的比较

模型组的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平（图2）。

2.3各组Gsk3β、β-catenin蛋白表达水平的比较

模型组的Gsk3β、β-catenin表达水平显著高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显著低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调Gsk3β、β-catenin的表达水平（图3）。

3讨论

肝病是一种常见疾病，会对人体健康造成不同程度的影响。肝纤维化是慢性肝病所共有的病理改变，是肝脏对慢性损伤的修复反应，被视为各种慢性肝病导致严重后果的共同途径[4]。如何促进肝纤维化的逆转，是预防和治疗肝硬化的有效方法之一。

丹参是一种临床应用较多的中药之一，被广泛应用于抗肝纤维化治疗之中。丹参中含有的丹酚酸A是丹参的主要水溶性成分之一，在丹参水溶性成分中占有重要地位[5]。研究显示，丹酚酸A具有很强的抗氧化、抗肝损伤、抗肝纤维化等作用[6]，可以通过清除超氧阴离子和羟自由基，抑制脂质过氧化反应，进而减轻肝损伤。鲁珽等[7]的动物实验显示，针对CCl4致大鼠肝纤维化实施丹酚酸A注射治疗效果确切，治疗效果显著优于口服50 mg/kg丹酚酸胶囊治疗，可以发挥出更好的抗肝纤维化作用，能够更好地改善实验动物的临床体征，并改善动物的肝脏器系数等指标。丹酚酸A可以抑制体外培养的成纤维细胞，激活胶原酶，促进胶原蛋白降解[8]。体内实验显示，丹酚酸A可降低CCl4慢性中毒大鼠的血清ALT、AST活性和肝组织丙二醛的含量，进而从整体上证实了丹酚酸A有显著抗脂质过氧化肝损伤的作用[9]。另外，丹酚酸A还可降低肝脏羟脯氨酸的含量，减轻肝组织纤维化程度，抑制肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积，具有显著的抗肝纤维化作用[10]。丹酚酸A还可以抑制HSC的活化与增殖，减少ECM的合成，阻止肝纤维化的进程，因此，丹酚酸A可作为抗肝纤维化治疗的有效药物，丹酚酸A抑制肝星状细胞增殖与胶原表达是其抗肝纤维化的主要作用机制[11]。通过本次研究发现，经Western blot检测，模型组α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平。肝纤维化的出现是由人体内以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质合成与降解发生失衡现象所导致，正常情况下，人体的肝脏中细胞外基质在合成以及降解方面处于动态平衡的状态[12]，其中，肝星状细胞是合成细胞外基质的主要来源，在一定情况下，肝脏受损之后，肝星状细胞便会发生一定的变化，被激活或转分化为肌纤维母细胞[13]，进而表达大量的α-SMA及细胞珠蛋白，并分泌出大量的细胞外基质；同时，其可以通过正反馈的方式，对肌纤维母细胞的增殖产生明显的调节作用[14]，而且在合成细胞外基质的同时，肝星状细胞也会分泌大量对细胞外基质产生降解作用的基质金属蛋白酶（MMPs）[15]。本次研究结果还显示，模型组α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显著高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调上述指标的表达水平；模型组Gsk3β、β-catenin表达水平显著高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显著低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的治疗之后可以显著下调Gsk3β、β-catenin的表达水平，提示丹酚酸A在治疗β肝纤维化的过程中，发挥相关作用的机制可能是通过对经典的Wnt信号转导通路予以抑制，进而促使肝星状细胞增殖水平的下降，以及细胞外基质降解的增加来予以实现[16]。endprint

综上所述，通过本次研究，从组织水平、蛋白水平和基因水平证实丹酚酸A可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来抑制肝纤维化，从而为利用丹酚酸A治疗肝纤维化提供新的治疗靶点，为丹酚酸A在肝纤维化中的临床应用提供了理论基础。

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