肉苁蓉低分子糖对巨噬细胞激活作用的研究

张雨荷　王丽超　屠鹏飞　曾克武　姜勇

[摘要]探究肉苁蓉低分子糖对RAW2647小鼠巨噬细胞的激活作用及潜在机制。该实验将RAW2647细胞分为正常对照组、细菌脂多糖（LPS）阳性对照组、肉苁蓉低分子糖处理组，其中肉苁蓉低分子糖的给药浓度为391～625 g·L-1。采用中性红法检测巨噬细胞吞噬活性，一氧化氮（NO）试剂盒检测NO的释放量，Western blot法检测巨噬细胞激活相关蛋白（TNFα，IL6，IKKβ，pIKKβ，IκBα，pIκBα，NFκB，pNFκB）的表达。结果显示，肉苁蓉低分子糖对巨噬细胞具有激活作用，具体表现在：其可显著提高RAW2647细胞NO的释放量，并促进细胞因子TNFα和IL6的表达。同时，其还可显著提高NFκB的磷酸化及其上游关键信号蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化水平。另外，低分子糖中的甘露醇可以使巨噬细胞的吞噬活性显著提升。以上结果表明，肉苁蓉低分子糖对巨噬细胞具有激活作用，其潜在机制是通过NFκB信号通路来实现的，甘露醇可能是其中的一种关键活性单体成分。

[关键词]肉苁蓉低分子糖； 免疫激活； 巨噬細胞； 炎症因子； NFκB

[Abstract]To investigate the immune activation effect and mechanism of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola（LMSC） on mouse peritoneal macrophages， RAW2647 cells The RAW2647 cells were divided into the normal control group， LPS positive control group， and LMSC treatment groups The RAW2647 cells were treated with various concentrations of LMSC from 391 to 625 g·L-1 The neutral red assay was employed to detect the phagocytic activity of macrophages NO release was detected by using NO kit， and macrophage activation associated protein expression levels （TNFα， IL6， IKKβ， pIKKβ， IκBα， pIκBα， NFκB， and pNFκB） were detected by Western blot Results showed that LMSC had an activation effect on macrophages； it can significantly increase the release of NO in RAW2647 cells and promote the expression of cytokines TNFα and IL6 Moreover， LMSC significantly increased the phosphorylation of IKKβ， IκBα， and NFκB p65 Furthermore， mannitol′s one of the main constituents in LMSC significantly enhanced the phagocytic activity of macrophages These results showed that LMSC could activate macrophages by upregulating the NFκB signaling pathway， and mannitol may be one of the main active components in LMSC.

[Key words]Low molecular weight saccharides； Cistanche deserticola； immune activation； macrophage； inflammatory factor； NFκB

肉苁蓉Cistanche deserticola Y C Ma为列当科肉苁蓉属植物，其肉质茎可入药，具有补肾阳、益精血、润燥通肠等功效，被誉为“沙漠人参”。肉苁蓉的化学成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、糖类、木脂素类等多种类型。现代药理学研究发现，肉苁蓉具有神经保护、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化等诸多生物学活性[1]。有研究表明，肉苁蓉的水煎物以及多糖都可明显提高巨噬细胞吞噬能力以及分泌功能[23]。但是，对于其低分子糖类的活性研究尚未见报道。因此，本研究利用RAW2647小鼠腹腔巨噬细胞体外培养体系，探讨了肉苁蓉低分子糖类的免疫调节活性及相关机制。该研究可为今后全面理解肉苁蓉的免疫调节作用提供更多的实验证据，从而进一步指导其临床应用。

1材料

RAW2647细胞购自中国医学科学院细胞中心；胎牛血清（FBS）购自德国PAN Biotech公司；抗生素、DMEM培养基购自中科迈晨科技有限公司。大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS）购自美国Sigma公司。一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；肉苁蓉总苷、肉苁蓉低分子糖、肉苁蓉多糖由本课题组自制，其中肉苁蓉总苷的质量分数为7876%，肉苁蓉低分子糖的质量分数为5800%，肉苁蓉多糖的质量分数为6524%。Tanon5200Multi凝胶成像分体系统购自上海天能科技有限公司；SunriseBasic酶标仪购自TECAN公司。endprint

2方法

21中性红法测定巨噬细胞吞噬活性取对数生长期的小鼠腹腔巨噬细胞，胰酶消化后，进行细胞计数，将细胞数调整为5×104个/mL，接种于96孔细胞培养板，100 μL/孔，于37 ℃，5%CO2条件下进行培养，待细胞贴壁后，弃去培养上清液，分别加入DMEM培养基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉苁蓉总苷、肉苁蓉总多糖、肉苁蓉低分子糖（分别为391～625 g·L-1，给药前用滤膜过滤）进行培养。培养48 h后，每孔加入0075%中性红生理盐水溶液100 μL，继续培养4 h，吸弃上清液，用PBS洗3遍，每孔加入细胞裂解液（冰醋酸乙醇1∶1）100 μL，4 ℃下放置2 h，待细胞裂解后测定吸光度（A540 nm）。

22细胞上清液中NO释放量检测将RAW2647细胞接种于48孔板（1×105个/mL，500 μL/孔），过夜孵育后吸弃细胞培养基，分别加入DMEM培养基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉苁蓉总苷、总多糖、低分子糖（分别为391～625 g·L-1）各500 μL。诱导培养24 h后，收集上清液。用NO试剂盒测定各组细胞上清液中NO浓度，按照说明书操作，最后用酶标仪检测吸光度（A570 nm）。

23Western blot将RAW2647细胞接种于6孔板，过夜孵育后吸弃细胞培养基，分别加入DMEM培养基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉苁蓉总多糖、低分子糖（391～625 g·L-1）各2 mL，诱导培养24 h后，弃去上清液。细胞用PBS洗2遍，弃去。胰酶消化后，将细胞吹打下来。离心，去上清液，加入100 μL NP40裂解液，冰上裂解40 min。离心后取上层清液，BCA法测定蛋白浓度，并调匀各组蛋白浓度。

取等量蛋白样品于12%SDSPAGE，恒压条件下进行分离。然后用BioRad转移电泳槽350 mA恒流转膜1 h，将蛋白转移至PVDF膜上（PVDF膜的预处理：甲醇浸泡后用转膜缓冲液平衡）。室温下用5%脱脂牛奶（用含有01%吐温20的TBST配置）封闭1 h后，用TBST洗膜3次，将膜置于蛋白一抗稀释液中4 ℃过夜孵育。隔天用TBST洗膜3次，加入相应二抗稀释液，孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光显影液对条带显影。

24数据分析数据均采用±s表示，差异显著性检验采用GraphPad Prism 6统计软件进行单因素方差分析。以P< 001作为具有非常显著性差异，P<005为具有显著性差异。

3结果

31肉苁蓉低分子糖、总苷以及总多糖对RAW2647细胞吞噬活性的影响有关肉苁蓉化学成分的研究表明，肉苁蓉中主要含有苯乙醇苷、环烯醚萜苷类和糖类成分，本实验选择肉苁蓉总苷（含苯乙醇苷和环烯醚萜苷）、低分子糖和总多糖3种活性部位考察其对RAW2647细胞激活的影响。肉苁蓉多糖和肉苁蓉低分子糖均能显著提高RAW2647细胞的吞噬活性，而总苷部位给药组的细胞吞噬活性变化不明显。此外，阳性对照药LPS也明显提高了RAW2647细胞的吞噬活性，见图1。以上结果提示，肉苁蓉低分子糖和多糖可能具有激活RAW2647细胞的作用。

与对照组相比1） P<001，2） P<005（图2～5同）。

32肉苁蓉总苷、低分子糖和总多糖对细胞上清液中一氧化氮（NO）含量的影响为进一步考察肉苁蓉3种活性部位对RAW2647细胞的激活作用，分别测定了不同药物刺激后的细胞上清液中NO的含量。结果显示，LPS组NO释放量显著高于空白对照组（P<001）；肉苁蓉低分子糖和多糖5个剂量的给药组NO释放量皆显著高于对照组（P<001），且呈剂量依赖性；肉苁蓉总苷没有显著影响。以上结果表明，肉苁蓉多糖和低分子糖均有促进RAW2647细胞释放NO的作用，其中肉苁蓉低分子糖效果尤其显著，见图2。

33肉苁蓉低分子糖对RAW2647细胞TNFα和IL6蛋白表达的影响TNFα是RAW2647细胞激活反应过程中出现的一种重要的炎性介质，可以促使其他细胞因子（如IL6）的合成和释放。结果显示，肉苁蓉低分子糖刺激后，TNFα和IL6的表达量显著提高，提示肉苁蓉低分子糖可能通过促进RAW2647细胞表达TNFα和IL6蛋白，进而激活细胞的免疫吞噬功能，见图3。

34肉苁蓉低分子糖对IKKβ/IκBα/NFκB信号通路的调控作用为了探究肉苁蓉低分子糖激活RAW2647细胞的潜在作用机制，作者考察了其对IKKβ/IκBα/NFκB经典信号通路的调控作用。肉苁蓉低分子糖能够显著提高NFκB磷酸化以及其上游的关键信号蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，并且降低IκBα总蛋白的表达，表明其对IKKβ/IκBα/NFκB信号通路具有激活作用。阳性对照药LPS也具有类似的调控效果。综上所述，肉苁蓉低分子糖可能通过激活IKKβ/IκBα/NFκB信號通路，进而引起TNFα和IL6等细胞因子的合成与释放，最终引起RAW2647细胞的免疫激活，见图4。

35肉苁蓉低分子糖中具有巨噬细胞激活作用的活性成分筛选本实验室前期已对肉苁蓉所含的低分子糖类进行了分析，发现主要含有甘露醇（1653%）、蔗糖（834%）、果糖（2538%）、葡萄糖（775%）等成分。于是作者利用中性红法对上述成分对巨噬细胞的激活作用进行了筛选。甘露醇可显著提高巨噬细胞的吞噬活性，且具有剂量依赖性，而其他成分作用不显著。这提示甘露醇可能是肉苁蓉低分子糖中激活巨噬细胞的关键活性成分之一，见图5。

4讨论

列当科寄生植物肉苁蓉被报道具有免疫调节作用，因此其应该含有免疫调节作用的物质。本实验中，作者对肉苁蓉的不同纯化部位进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的筛选后，发现肉苁蓉低分子糖和肉苁蓉多糖具有巨噬细胞激活作用，而肉苁蓉总苷不明显。同时作者发现，低分子糖类在较低浓度下即可对巨噬细胞产生激活作用，因此作者选择肉苁蓉低分子糖类作为后续研究重点。endprint

通过检测肉苁蓉低分子糖对细胞因子TNFα和IL6表达的影响，作者发现肉苁蓉低分子糖使TNFα和IL6的表达量显著提高，这进一步证明肉苁蓉低分子糖对小鼠腹腔巨噬细胞有激活作用。于是作者又进一步探究了其潜在的作用机制。有研究表明，细菌脂多糖（LPS）可通过JAK2/STAT3，NFκB，p38/ERK，MAPK等信号通路诱导小鼠巨噬细胞和小鼠胶质细胞活化[48]。NFκB通路是公认的一条经典通路，因此本实验中对这条通路上的信号蛋白进行了检测。结果发现，肉苁蓉低分子糖能够显著提高NFκB磷酸化以及其上游的关键信号蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，提示肉苁蓉低分子糖可能通过IKKβ/IκBα/NFκB信号通路激活小鼠腹腔巨噬细胞释放炎性细胞因子，进而发挥细胞免疫激活作用。

实验室前期对肉苁蓉低分子糖提取物的化学成分进行了系统分析。发现低分子糖中主要含有甘露醇、蔗糖、果糖、葡萄糖等单体。进一步研究结果发现，甘露醇对巨噬细胞的吞噬活性有显著的提高作用，因此推测甘露醇可能是低分子糖中具有激活细胞免疫功能的关键成分。

综上所述，本研究利用巨噬细胞体外培养体系，发现了肉苁蓉低分子糖对巨噬细胞有显著激活作用，并且可能通过NFκB信号通路激活小鼠腹腔巨噬细胞，进而发挥作用。低分子糖中的甘露醇可能对激活巨噬细胞的吞噬活性具有重要作用。

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[責任编辑张宁宁]endprint