不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病模型大鼠的保护作用

2017-11-17刘靑朱萱萱王琼

中国医药导报 2017年28期

刘靑　朱萱萱　王琼

[摘要] 目的比較不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病模型大鼠的保护作用。方法选用健康SD鼠54只，雄性，8周龄。采用高糖高脂饲料+单侧肾脏结扎术+腹腔注射STZ（40 mg/kg）的方法建立糖尿病肾病模型，造模成功后将其分为五组：模型组、厄贝沙坦组、工艺1组（水煮浓缩方）、工艺2组（水煮醇提浓缩方）、工艺3组（水提醇提浓缩合并方），另设空白组。三种不同工艺芪葵颗粒以相同剂量18.67 g/kg分别于造模成功后连续给药5周，观察不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠血糖、尿蛋白、肌酐、内生肌酐清除率的影响，并行病理组织学检查。结果与空白组比较，模型组大鼠体重显著降低（P < 0.01），进食量、饮水量、尿量明显增加（P < 0.05或P < 0.01），血糖明显升高（P < 0.01）。给药干预后，与模型组比较，各给药组体重不同程度增加，进食量、饮水量、尿量不同程度减少；工艺2组和工艺3组血糖明显降低（P < 0.05）；厄贝沙坦组和工艺3组血肌酐明显降低（P < 0.05或P < 0.01）；各给药组内生肌酐清除率明显升高（P < 0.05或P < 0.01）；厄贝沙坦组以及工艺2、3组尿蛋白排泄率明显降低（P < 0.01或P < 0.05）。病理组织学结果显示，模型组大鼠肾脏主要表现为肾小球肥大、肾小管扩张、间质及肾盂炎细胞灶性浸润；与模型组比较，各给药组肾脏病变范围和程度略有减轻，以厄贝沙坦组和工艺2组肾小球和肾小管病变减轻略为明显。结论不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病的保护作用与降低血糖、肌酐和尿蛋白排泄和减轻肾脏病变有关。以工艺2组与工艺3组较为明显。

[关键词] 糖尿病肾病；芪葵颗粒；血糖；肌酐清除率；尿蛋白排泄率；病理组织学

[中图分类号] R285.5；R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0025-06

[Abstract] Objective To compare the protective effects of different processes of Qikui Particles for model rats with diabetic nephropathy. Methods Fifty-four healthy SD rats （male， 8 weeks old） were selected. The model rats with diabetic nephropathy were induced by high sugar/fat diet + unilateral nephritic ligation + Streptozotocin （STZ， 40 mg/kg， ip）. After successful establishment of model rats， they were divided into 5 groups： model group， Irbesartan group， process 1 （water boiled concentrated decoction） group， process 2 （water boiled and alcohol extraction concentration） group， process 3 （the mixed of above two processes） group， and the blank group was set up. Qikui Particles prepared under 3 different processes were orally administered at the same dose （18.67 g/kg ） for 5 consecutive weeks. The effects of different processes of Qikui Particles on blood sugar， urinary protein， creatinine and endogenous creatinine clearance rate in rats with diabetic nephropathy were observed， and histopathology was detected. Results Compared with blank group， the body weight in model group was decreased significantly （P < 0.01）， the food-intake， water consumption and urine volume were increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the blood sugar was improved significantly （P < 0.01）. After drug intervention， compared with model group， the body weight in each drug administration group was increased more or less， the food-intake， water consumption and urine volume were decreased more or less； the blood sugar in process 2 group and process 3 group was decreased significantly （P < 0.05）； the serum creatinine in Irbesartan group and process 3 group was decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）； the endogenous creatinine clearance rate in each drug administration group was increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）； the urinary protein excretion rate in Irbesartan group and process 2， 3 group was decreased significantly （P < 0.01 or P < 0.05）. The results of histopathology showed that the main performance of kidney in model groups was glomerular hypertrophy， tubular dilation， interstitial and renal pelvis focal infiltration of inflammatory cells； compared with model group， the scope and extent of renal injury were reduced slightly in each drug administration group， especially in Irbesartan group and process 2 group. Conclusion The protective effects of different processes of Qikui Particles for diabetic nephropathy are related to the decrease of blood sugar， creatinine， urinary protein and alleviation of renal injury， especially in process 2 group and process 3 group.endprint

[Key words] Diabetic nephropathy； Qikui Particles； Blood sugar； Creatinine clearance rate； Urinary albumin excretion rate； Histopathology

糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症之一，在糖尿病人群中的发生率为20%～40%，是糖尿病致命的主要原因。目前我国糖尿病肾病发病率也呈逐年增多趋势，越来越成为亟待解决的肾脏病变。对糖尿病肾病的防治已成为国内外研究的热点[1]。因此，对糖尿病肾病进行早期诊断，并采取有效措施延缓其发展至关重要。芪葵颗粒是江苏省中医院（以下简称“我院”）医疗机构制剂，来源于内分泌名中医余江毅主任的经验方，由黄芪、黄蜀葵花等中药组成，具有健脾胃、补肝肾的功能，临床上用于治疗糖尿病肾病，疗效显著。临床研究表明，芪葵颗粒对糖尿病肾病阴虚络瘀证患者蛋白尿水平有较好的疗效，能够显著改善糖尿病肾病患者的临床进程[2-4]。然而，目前的研究对于芪葵颗粒改善糖尿病肾病及其相关病变的主要作用环节和机制的阐明并不充分。基于以上研究背景，本研究在大鼠糖尿病肾病模型中，对3种不同工艺制备的芪葵颗粒的药效和关键指标进行了评价，观察其对糖尿病肾病大鼠血糖、尿蛋白排泄率、肌酐清除率以及肾脏病理组织学的影响，以期寻找芪葵颗粒改善糖尿病肾病的关键环节，并为临床应用提供更为充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料

清洁级SD大鼠，雄性，8周龄，体重200～220 g，由南通大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-（苏）2014-0001。全价营养颗粒饲料（批号20150330）、高糖高脂饲料（配方：基础饲料∶蛋黄∶猪油∶胆酸钠∶蔗糖=63.5∶10∶8∶0.5∶18，批号：20150330）均由江苏省协同医药生物技术有限公司提供。室温（20±2）℃，湿度55%～65%，光照适度，通风洁净良好。

1.2 仪器与试药

血糖仪（Bayer HeaithCare LLC，型号1455）；拜安捷血糖试纸（Bayer HeaithCare LLCFA1004）；电子分析天平（上海精科天平厂）；全自动生化仪（Beckman Coulter Au480）。

芪葵颗粒（由我院制剂部提供，批号150 318）；链脲佐菌素（STZ）（Sigma，批号078K1577V）；柠檬酸（QCBio，批号5949291）；柠檬酸钠（QCBio，批号6132043）。

脑脊液与尿蛋白测定试剂盒（浙江康特生物科技有限公司，批号B150312）；葡萄糖测定试剂盒（浙江康特生物科技有限公司，批号A150408）；肌酐测定试剂盒（浙江康特生物科技有限公司，批号A150214）；尿素氮测定试剂盒（浙江康特生物科技有限公司，批号A150317）。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病肾病大鼠模型的建立雄性健康SD大鼠54只，适应性饲养1周后，实验前用代谢笼收集大鼠尿液测定尿糖，尿蛋白定性为阴性后开始手术。术前禁食12 h后，用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪去腹部手术部位的毛，皮肤消毒后于剑突下1.5 cm沿腹中线切开皮肤及肌肉层，右手指深入腹腔摸着肾脏，左手指从腹部外侧配合将肾脏轻轻挤出，用浸有生理盐水的纱布包住，将其固定。于左肾近肾门处小心分离左肾动脉后，穿线打结，缝合腹部切口，碘酒消毒。术后1周后造模组给予高糖高脂饮食，空白组术前禁食12 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，皮肤消毒后于剑突下1.5 cm沿腹中线切开皮肤及肌肉层，不做处理，缝合腹部切口，正常饮食[5-7]。2周后造模组按40 mg/kg体重腹腔注射2%STZ（链脲佐菌素）。空白组（假手术组）腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。实验期间动物自由进食、饮水。

1.3.2 动物分组与给药 STZ造模72 h后大鼠尾尖部采血测定血糖，以血糖值11.4 mmol/L以上者为合格动物。按照血糖分为空白组（8只）、模型组（14只）、给药组[厄贝沙坦组（0.04 g/kg），芪葵颗粒工艺1组（以下简称“工艺1组”），芪葵颗粒工艺2组（以下简称“工艺2组”），芪葵颗粒工艺3组（以下简称“工艺3组”），各组相当于18.67 g/kg，每组10只]。给药组分别灌胃给予同体积不同浓度药物10 mL/kg，空白组和模型组给予同体积生理盐水，每日1次，10 mL/kg，连续5周。给药过程中每周称重，测定大鼠进食量、饮水量及尿量。

1.4 观察指标

①尿蛋白及尿肌酐测定：分别于实验末收集各组大鼠24 h尿液，测定尿蛋白及尿肌酐含量。②血清檢测：各组大鼠取血，检测血糖含量，离心所得血清标本采用全自动生化分析仪检测血尿素氮、血肌酐水平。③HE染色进行病理组织学检查。

1.5 统计学方法

本研究采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠体重的影响

与空白组比较，模型组大鼠体重显著降低（P < 0.01）。给药后，与模型组比较，厄贝沙坦组、工艺1组、工艺2组及工艺3组大鼠体重均有不同程度的增加（P < 0.01或P < 0.05）。工艺1组、工艺2组及工艺3组大鼠体重与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠进食量的影响

与空白组比较，模型组给药1、2周后进食量明显增加（P < 0.05）。与模型组比较，各给药组给药第2周以及工艺1、2、3组给药4周大鼠进食量均显著减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。工艺1组、工艺2组及工艺3组大鼠进食量与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。endprint

2.3 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠饮水量的影响

与空白组比较，模型组大鼠给药前及给药1、2、3周饮水量明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，工艺2组和工艺3组大鼠给药后第4、5周饮水量均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。工艺1组、工艺2组及工艺3组大鼠饮水量与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

2.4 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠尿量的影响

与空白组比较，模型组大鼠给药后尿量均明显增多，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与模型组比较，各给药组尿量给药第2周开始均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。工藝1组、工艺2组及工艺3组大鼠尿量与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

2.5 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠血糖的影响

与空白组比较，模型组大鼠血糖持续升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，厄贝沙坦组以及工艺2、3组给药4周后血糖明显降低，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。工艺1组、工艺2组及工艺3组大鼠血糖与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表5。

2.6 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠血肌酐、血尿素氮和内生肌酐清除率的影响

给药4周后，与空白组比较，模型组大鼠血肌酐、血尿素氮明显升高，内生肌酐清除率显著降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，厄贝沙坦组和工艺3组血肌酐明显降低（P < 0.05或P < 0.01），各给药组血尿素氮明显降低，内生肌酐清除率明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与厄贝沙坦组比较，工艺2组大鼠的血肌酐以及工艺3组大鼠的内生肌酐清除率均明显升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表6。

2.7 不同工艺芪葵颗粒对糖尿病肾病大鼠尿蛋白与尿蛋白排泄率的影响

给药4周后，与空白组比较，模型组大鼠尿蛋白排泄率明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，厄贝沙坦组以及工艺2、3组尿蛋白排泄率明显降低，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。与厄贝沙坦组比较，工艺2组大鼠尿蛋白和尿蛋白排泄率均显著升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表7。

2.8 病理组织学结果

空白组：肾小球无病变，肾小管上皮无变性坏死，肾小管无扩张，间质无炎细胞浸润，无纤维结缔组织增生。模型组：多数肾小球轻至中度肥大，部分肾小管扩张，肾小管上皮细胞空泡样变性，间质血管扩张充血，可见炎细胞灶状浸润，肾盂黏膜下亦可见部分炎细胞浸润。个别动物肾小管管腔内可见蛋白管型及细菌菌落散在分布。与模型组比较，不同工艺芪葵颗粒肾脏病变范围和程度略有减轻，以厄贝沙坦组和工艺2组肾小球和肾小管病变减轻略为明显（图1）。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病严重而常见的并发症，直接威胁糖尿病患者的预后[8-10]。现代医学研究认为，糖尿病肾病的发病机制主要与长期持续高血糖导致的肾脏血流动力学改变、脂代谢紊乱、氧化应激、细胞因子和生长因子释放、遗传因素等有关，但其确切的发病机制仍未阐明[11-13]。

糖尿病肾病属于中医“消渴肾病”范畴，多数学者认为消渴并发“水肿”“水病”和“尿浊”等与糖尿病肾病相近，《圣济总录》记载“消肾，小便白浊如凝脂，形体羸弱”，明确指出消渴肾病时会出现蛋白尿[14]。消渴肾病是在糖尿病以阴虚为本、气阴两虚为基本证型的基础上进一步演变而来，并认为“气阴两虚”是消渴肾病的重要病机[15]。近年来进一步认识到糖尿病肾病病机有以下特点：气阴两虚是糖尿病肾病早期的基本病机；湿热是糖尿病肾病进展的重要因素；瘀血既是糖尿病肾病的病理产物，也是糖尿病肾病进展的关键因素。我院内分泌科余江毅主任参照国内外对糖尿病肾病的研究成果及多年临床经验，认为“气阴两虚、湿瘀阻络”是糖尿病肾病的基本病机，提出“利湿泻浊，化瘀通络”的治疗原则，对糖尿病肾病阴虚络瘀证患者蛋白尿水平的降低有较好的疗效，能显著改善糖尿病肾病患者的临床进程。

糖尿病肾病的临床诊断依据蛋白尿的出现。糖尿病肾病早期改变主要为肾小球滤过率增高、肾小球肥大、肾小球毛细血管基底膜增厚、系膜区扩张[16-17]。本研究采用的工艺为：工艺1组为处方中黄芪、酒萸肉等所有药味全部水提，减压浓缩，一步法工艺制粒。工艺2组为黄芪、酒萸肉等水提，滤过，浓缩至适量；黄蜀葵花等醇提，回收乙醇后与水提浓缩液混合，一步法工艺制粒。工艺3组为黄芪、酒萸肉等水提，醇沉；黄蜀葵花等醇提，滤过，滤液与黄芪、酒萸肉水提醇沉上清液合并，回收乙醇，继续浓缩后，一步法工艺制粒。

本研究结果显示，给予不同工艺芪葵颗粒可改善糖尿病肾病大鼠多尿、体毛干枯无光泽、精神萎靡、活动减少等症状，可显著降低糖尿病肾病大鼠血糖、尿素氮、肌酐和尿蛋白含量、尿蛋白排泄率。肾脏病理组织学结果也显示模型组多数肾小球轻至中度肥大，肾小管扩张及上皮细胞空泡样变性，间质血管扩张充血，炎细胞灶状浸润，个别动物肾小管管腔内可见蛋白管型及细菌菌落散在分布。与模型组比较，不同工艺芪葵颗粒可使肾脏病变范围和程度略有减轻，以工艺2组肾小球和肾小管病变减轻略为明显。通过以上不同工艺的比较和工艺制备流程适应批量生产确定为工艺2组为芪葵颗粒的最终工艺。

本研究采用单侧肾结扎+高糖高脂+STZ注射制备糖尿病肾病模型。因单侧肾结扎后加重对侧肾脏负荷，导致对侧肾脏代偿性肥大，而肾脏肥大是糖尿病肾病的一个独立危险因素，予高糖高脂饮食+STZ注射造成糖尿病模型，加速糖尿病肾病的形成，与临床上糖尿病肾病患者表现为持续蛋白尿和进行性肾功能损害基本相似[18-20]。用此法造模，所需时间短，可以作为研究糖尿病肾病的理想工具，但操作复杂且动物死亡率高，所以在实验设计时建议增加动物数量。endprint

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