鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

王淑菁 付 瑞 李晓波 王 吉 岳秉飞

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050）

鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

王淑菁 付 瑞 李晓波 王 吉 岳秉飞

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050）

目的：建立鸡胚致死孤儿病毒CELO的荧光定量PCR检测方法，实现该病毒在鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测。方法 根据CELO L5 纤突1序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR检测方法，并对其线性、特异性、精密性、灵敏度进行考察。运用建立的方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种进行CELO检测。结果：建立的荧光定量PCR其最佳线性范围为1x109～1x104拷贝/μl，R2值达0.99以上，特异性良好，与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应，灵敏度为102拷贝/μl；荧光定量PCR方法检测40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感毒种结果为阴性。结论：本研究所建立的鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法，特异性好，敏感性高，为鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测提供了技术支撑。

鸡胚致死孤儿病毒；荧光定量PCR；鸡胚

鸡胚致死孤儿病毒（CELO）属于禽腺病毒I型，为无包膜双股DNA病毒，主要引起鸡的包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染、出血性肠炎和产蛋量减少，常与禽类呼吸道病原微生物混合感染，导致死亡率增加[1，2，3]。2008年制定的SPF鸡微生物学监测国家标准中要求SPF鸡和鸡胚需要排除禽腺病毒I型的感染[4]。此外，2015年版《中国药典》中也规定流感病毒主种子毒种也需要进行外源性禽腺病毒I型的检测，排除外源性病毒的污染[5]。

目前国标中规定的禽腺病毒I型的检测方法是琼脂扩散法，该方法耗时较长，敏感性差[4]。本研究旨在建立一种检测禽腺病毒I型代表株CELO病毒的荧光定量PCR方法，能够快速、灵敏的检测CELO病毒。

1 材料与方法

1.1 病毒

CELO毒种（ATCC VR-432）购于ATCC；禽腺病毒III型（EDS株）购于中国兽药监察所；小鼠腺病毒（MAdV）均购买于ATCC；猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均为本科室保存。H1N1、H3N2、B型流感病毒为疫苗厂家送检毒种。

1.2 主要试剂

Takara MiniBEST Viral RNA/DNA 提取试剂盒试剂盒购自TaKaRa公司；TaqMan Universal PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司。SPF鸡胚购买于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3 荧光定量PCR方法的建立

1.3.1 质粒标准品的构建

扩增CELO29763-30208区域，得到446bp目的片段，测序后将目的片段转入pMD19-T质粒中，作为CELO质粒标准品。

1.3.2 方法的建立

针对CELO六邻体蛋白446bp保守序列设计引物和探针，引物和探针序列如下：CELO-F：CGCTTACTGCCGTTTAGCT，CELO-R：GGCATAGCTTGTCACTTGAATGGT，

探针：FAM-CCGCTGACCACGCCAC-NFQ，探针标记FAM荧光基团。引物与探针均由英俊上海公司合成部合成。PCR反应体系为：TaqMan Universal PCR Master Mix 10μl，探针引物混合物（10μM）1μl，无RNA酶水7μl，模板2μl。反应条件：50℃2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。

1.3.3 标准曲线的绘制及最佳线性范围的确定

建立的荧光定量PCR方法对各浓度的质粒标准品均进行考察，绘制标准曲线，并确定该方法的最佳线性范围。

1.3.4 特异性考察

提取CELO、禽腺病毒III型EDS、鼠腺病毒，猴腺病毒-1，猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒的核酸DNA，进行荧光定量PCR，考察该引物和探针的特异性。

1.3.5 灵敏度考察

倍比稀释构建的质粒标准品，从109至100拷贝/μl，每个稀释度重复三次，考察该方法的灵敏度，以阳性检出率为100%的最低稀释倍数为该方法的灵敏度。

1.4 方法的应用

使用荧光定量PCR方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感病毒主种子批毒种进行检测。其中16株流感病毒毒种包括3株H1N1亚型、6株H3N2亚型、7株B亚型.

2 结果

2.1 荧光定量PCR方法的建立

2.1.1 标准曲线及最佳线性范围：当CELO标准质粒分别在109～104拷贝/μl时，标准曲线的线性关系良好，R2值可达0.998，扩增效率为96.184%。

2.1.2 特异性：检测结果显示，当检测CELO病毒时，出现FAM荧光扩增曲线。禽腺病毒III型、鼠腺病毒、猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒提取DNA样品均无明显扩增曲线。表明所建立的荧光定量PCR法特异性良好，与其他腺病毒及流感病毒株无交叉反应。见图1

图1 荧光定量PCR方法的特异性

2.1.3 灵敏度：以阳性检出率为100%的最低稀释倍数为该方法的灵敏度，检测结果显示，该方法检测CELO标准质粒的灵敏度为102拷贝/μl。见图2。

图2 荧光定量PCR方法的灵敏度

2.2 方法的应用

使用荧光定量PCR方法检测40份鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种中是否存在CELO污染，结果显示阳性对照CELO毒种出现S型扩增曲线，40份鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种扩增曲线均无抬起，判定为CELO阴性。见图3。

图3 40份鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种CELO荧光定量PCR检测结果

3 讨论

目前新建立的CELO荧光定量PCR方法对于检测鸡胚和禽源性生物制品中是否存在外源性CELO病毒污染具有重要意义。新建立的CELO荧光定量PCR检测方法与传统的血清学检测方法相比，建立的荧光定量PCR灵敏度高，最低检测可达102拷贝/μl，特异性好，与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应，检测时间更短，仅需要1天时间即可完成全部实验。对于污染了极其微量的外源性CELO病毒时也可以及时检出，更好的保证鸡胚和禽源性生物制品的安全性。

[1]周斌，刘华雷，曹瑞兵.污染疫苗的禽腺病毒分离和鉴定[J].南京农业大学学报，2004，27（3）：78-80.

[2]付瑞，王淑菁，岳秉飞，等.鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法的建立与应用[J].实验动物科学，2012，29（4）：9-11.

[3]殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997.

王淑菁，女，助理研究员，研究方向：实验动物病毒学。