高效液相色谱法测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素

厉志伟，王盛莉

(湖南省玉峰食品实业有限公司，长沙 410019)

高效液相色谱法测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素

厉志伟，王盛莉*

(湖南省玉峰食品实业有限公司，长沙 410019)

采用超声波辅助甲醇提取辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素，高效液相色谱法进行测定。色谱条件：色谱柱为Symmetry○RC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相甲醇∶水为70∶30(V/V)，流速1.0 mL/min，紫外检测波长280 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。结果表明：辣椒素含量0.02～100 mg/L，二氢辣椒素含量0.02～50 mg/L，峰面积与待测物浓度呈良好的线性关系。辣椒素标准曲线的回归方程是Y=5.33e+003X+9.42e+002，相关系数为0.9999。二氢辣椒素标准曲线的回归方程是Y=5.96e+003X+4.71e+002，相关系数为0.9999。回收率为82.75%～105.49%。此方法样品前处理较国标方法更简单、省时，同时显著降低了溶剂成本，缩短了样品分析时间，更利于批量操作，具有较大优势。此方法可以用于HPLC 快速测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素。

高效液相色谱；测定；辣椒；辣椒素；二氢辣椒素

辣椒作为一种香辛料和调味品，在麻辣类休闲食品中起着至关重要的作用，可以保证产品口感的稳定，控制产品的辣感。辣椒中所含有的辛辣成分主要为辣椒素类物质，其中辣椒素(Capsaicin)和二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin)约占辣椒素总量的90%[1]，是辣椒中的主要活性成分，也是辣椒中辣味的主要来源，提供了约90%的辣感和热感，其含量的高低直接影响到辣椒及辣椒制品的辣度。因此，有必要对辣椒中的辣椒素和二氢辣椒素含量进行测定，以便为食品生产过程中辣椒配料用量的调整提供依据。

目前，辣椒素和二氢辣椒素测定的方法主要有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)、固相微萃取-气质联用(SPME-GC-MS)法等[2,3]，其中高效液相色谱法的应用最为广泛。国标[4]中所采用的方法也是高效液相色谱法。

国标及相关文献[5-11]记录中，样品前处理均采用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液作提取溶剂，其中四氢呋喃毒性较大[12]，对操作人员有一定的健康损害，且溶剂成本高；提取操作过程复杂，使用超声波反复提取多次，提取过程中多次使用滤纸，整个提取操作过程步骤繁琐、耗时较长；另外，样品分析时间也较长，不利于大批量的检测操作。本研究通过对辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素的提取方法和色谱条件的选择和优化，采用超声波辅助甲醇提取辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素，确定辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素的高效液相色谱紫外检测方法，并对该方法的准确性、精密度、回收率进行了研究验证。此方法样品前处理较简单，样品分析时间较短，色谱分离良好，定性、定量准确。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

样品:新一代辣椒、魔鬼椒、广西辣椒；超纯水；甲醇(HPLC)；辣椒素标准品(纯度97.5%)；二氢辣椒素标准品(纯度98.5%)：中国食品药品检定研究院。

Waters e2695高效液相色谱仪：配在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱，Waters 2489UV/Vis检测器，Empower色谱工作站 美国沃特世公司；ME204E电子分析天平(感量0.0001 g) 梅特勒-托利多公司；超声波清洗器(功率100 W) 宁波新芝生物科技股份有限公司；电动粉碎机(粒度≥40目)；离心机：转速不低于4000 r/min；烘箱；50 mL具塞塑料离心管；0.22 μm有机微孔滤膜；0.45 μm水系微孔滤膜。

1.3 溶液制备

1.3.1 标准溶液

1.3.1.1 标准储备液的配制

分别精确称取辣椒素、二氢辣椒素标准品0.0103，0.0102 g(精确到0.0001 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成含量均为1000 mg/L 的辣椒素、二氢辣椒素标准储备液。分别吸取辣椒素和二氢辣椒素标准储备液5,2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成浓度分别为500,250 mg/L的辣椒素和二氢辣椒素混合储备液。

1.3.1.2 标准工作液的配制

YU Long-juan, ZHANG Ming-fei, WANG Qin, SU Dong-ying, ZHU Xuan

按表1配成系列标准工作液。

表1 辣椒素、二氢辣椒素混合标准工作液浓度Table 1 Concentration of standard working solution of capsaicin and dihydrocapsaicin mg/L

1.3.2 样品溶液

将辣椒用烘箱在50 ℃下烘干至恒重[13]，用电动粉碎机粉碎，均过40目筛，称取2.5 g样品(精确到0.0001 g)于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇，超声提取30 min，离心机4000 r/min离心5 min[14]，将上清液转移至50 mL容量瓶中。然后将滤渣重新加甲醇20 mL，超声提取20 min，4000 r/min离心5 min。将2次收集的上清液合并, 用甲醇定容至50 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤后进行色谱分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Symmetry○RC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇∶超纯水为70∶30；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件的选择

2.1.1 提取溶剂的选择

根据国标及其他参考文献[15-18]，分别选用甲醇、甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液和80%乙醇水溶液作提取溶剂，结果表明用甲醇作提取溶剂提取效果最好，见图1。

图1 不同溶剂对辣椒素和二氢辣椒素提取结果的影响Fig.1 Extraction effects of different solvents on capsaicin and dihydrocapsaicin

注：1为甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液；2为甲醇；3为80%无水乙醇。

2.1.2 提取方法的选择

国标中推荐的样品处理方法是用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液作提取溶剂，将样品用保鲜膜封口，用针扎几个小孔，然后在60 ℃水浴条件下，超声波清洗器提取30 min，用滤纸过滤，收集滤液，然后将滤渣连同滤纸重新用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液25 mL，使用超声波清洗器提取10 min，重复2次。将3次过滤收集的滤液合并，用旋转蒸发器在70 ℃温度下浓缩至10～20 mL，再用甲醇+四氢呋喃(50+50)混合溶液定容后进行分析。此预处理操作繁琐、耗时较长，不利于批量样品测试试验，因此，有必要对样品预处理方法进行优化。本研究经过大量试验比较，结果发现：采用常温水浴超声辅助甲醇提取30 min，然后4000 r/min离心5 min，收集上清液，定容，实验结果与国标方法一致，见表2。

表2 不同提取方法对分析结果的影响Table 2 The effects of different extraction methods on analysis results g/kg

2.1.3 提取温度的确定

对超声提取法提取温度做进一步的确定，结果表明常温超声提取和60 ℃超声提取的检测结果之间差异不显著，故选择常温超声提取，见表3。

表3 不同提取温度对辣椒素和二氢辣椒素分析结果的影响Table 3 The effects of different extraction temperatures on capsaicin and dihydrocapsaicin analysis results g/kg

2.1.4 提取次数的确定

对超声提取法提取次数做进一步的确定，结果表明用甲醇提取2次，辣椒素和二氢辣椒素几乎提取完全，故选择提取2次，见表4。

表4 不同提取次数对辣椒素和二氢辣椒素分析结果的影响Table 4 The effects of different extraction times on capsaicin and dihydrocapsaicin analysis results g/kg

2.2 流动相条件的选择

设置流动相流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，选择不同比例的甲醇∶超纯水(65∶35～80∶20)作为流动相进行色谱分离实验，实验结果表明：提高甲醇比例可以缩短辣椒素及二氢辣椒素的出峰时间，降低甲醇比例有利于分离辣椒素及二氢辣椒素，但降低甲醇比例，色谱峰展宽，响应值降低,保留时间明显增加。当甲醇∶超纯水比为70∶30时，出峰时间合适(较国标方法节约8 min)，分离效果较好。综合分离效果、溶剂成本、时间成本，最终选择甲醇∶超纯水为70∶30作为流动相。此条件下的标样及试样色谱图见图2。

图2辣椒素和二氢辣椒素的色谱图
Fig.2 Chromatograms of capsaicin and dihydrocapsaicin

2.3 线性回归方程、线性范围及检出限

按1.3.1.2配制工作标液。按1.4条件测试，制作校准曲线。峰面积与待测物浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995。辣椒素标准曲线的回归方程是Y=5.33e+003X+9.42e+002，相关系数为0.9999。二氢辣椒素标准曲线的回归方程是Y=5.96e+003X+4.71e+002，相关系数为0.9999。

将空白测试产生的噪声的3倍作为仪器的检出限，辣椒素的仪器检出限约为0.02 mg/L，二氢辣椒素的仪器检出限约为0.005 mg/L。对逐步稀释的标准溶液进行重复性分析，当辣椒素和二氢辣椒素混合标准工作液浓度均为0.02 mg/L时，辣椒素RSD=4.13%(n=7)，二氢辣椒素RSD=4.36%(n=7)，符合要求。故辣椒素、二氢辣椒素测试仪器检出限均为0.02 mg/L。

2.4 精密度试验

取自配的浓度分别为1.0，0.5 mg/L的辣椒素和二氢辣椒素混合标准工作液，进样10 μL，重复测试7次，进行精密度试验。测定辣椒素RSD=2.01%(n=7)，二氢辣椒素 RSD=1.25%(n=7)。表明测试仪器在该色谱条件下有良好的精密度。

2.5 重复性试验

取同一批次广西辣椒，按1.3.2条件处理，制备7个平行样品溶液进行测定。辣椒素 RSD=1.91%(n=7)，二氢辣椒素RSD=2.10%(n=7)。表明该测试方法重复性良好。

2.6 加标回收试验

选用同一批次广西辣椒分别进行中水平浓度监控加标和基体加标试验，按上述方法测定，回收率为82.75%～105.49%。辣椒素和二氢辣椒素的平均回收率均在允许范围内(80%～110%)，表明测定方法的准确度达到要求，见表5。

表5 辣椒素、二氢辣椒素的回收率测定结果Table 5 Determination results of recovery rates of capsaicin and dihydrocapsaicin

注：监控加标-样品称取后，加入适量甲醇，加入标准溶液再超声萃取；基体加标-样品溶液合并后，加入标准溶液再定容。

3 结论

对辣椒中辣椒素、二氢辣椒素的提取，采用超声提取法，考察了不同提取溶剂、提取温度及提取次数的影响，建立了用甲醇作提取溶剂，常温条件下超声波提取(超声功率100 W)辣椒素、二氢辣椒素，采用高效液相色谱法测定辣椒中辣椒素、二氢辣椒素的方法。并与国标方法做了比较研究，试验结果一致。此方法具有简便快捷、准确度好、灵敏度高、成本低等特点。此方法样品前处理使用甲醇常温超声提取2次，使用溶剂体积为50 mL，较国标方法使用溶剂体积为100 mL的(甲醇+四氢呋喃为50∶50)混合溶液，节约了70%(四氢呋喃价格昂贵)的溶剂成本。在此方法色谱条件下，辣椒素的保留时间约为8.5 min，二氢辣椒素的保留时间约为11.6 min，与国标方法相比，单个样品检测时间大约能缩短8 min，在大批量的样品分析中能节省大量的时间和成本，具有实际应用价值。

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DeterminationofCapsaicinandDihydrocapsaicininCapsicumbyHighPerformanceLiquidChromatography

LI Zhi-wei, WANG Sheng-li*

(Hunan Yufeng Food Industry Co., Ltd., Changsha 410019, China)

Capsaicin and dihydrocapsaicin are extracted by ultrasonic with methanol as solvent, and then are detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The conditions of HPLC are taken as follows: the chromatographic column is Symmetry○RC18(5 μm, 4.6 mm×250 mm), and the mobile phase methanol∶ water is 70∶30 (V/V), the flow rate is 1.0 mL/min, and the ultraviolet detector wavelength is 280 nm, the column temperature is 35 ℃, and the sample injection volume is 10 μL.The results show that the content of capsaicin is in the range of 0.02～100 mg/L, the content of dihydrocapsaicin is in the range of 0.02～50 mg/L, it has a good linear relationship between peak area and concentration of the analyte. The regression equation of capsaicin standard curve is Y=5.33e+003X+9.42e+002, and the correlation coefficient is 0.9999. The regression equation of dihydrocapsaicin standard curve is Y=5.96e+003X+4.71e+002, and the correlative coefficient is 0.9999. The recovery rates are in the range of 82.75%～105.49%.The pretreatment of this method is simpler and less time consuming than the national standard method. It also reduces the solvent cost and shortens the sample analysis time and it is more convenient for batch operation. The method can be used for rapid determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in capsicum by HPLC.

HPLC；determination；capsicum；capsaicin；dihydrocapsaicin

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.027

1000-9973(2017)11-0123-04

2017-06-17 *通讯作者

湖南省科技计划项目(2016TP2028)

王盛莉(1978-)，女，硕士，研究方向：食品科学。